重組質粒pαACP-HSP70的特異性表達研究*

楊名慧，趙學發，葛正龍△（.遵義醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴州遵義563003；.黔南州人民醫院檢驗科，貴州都勻558000）

重組質粒pαACP-HSP70的特異性表達研究*

楊名慧1，趙學發2，葛正龍1△
（1.遵義醫學院生物化學與分子生物學教研室，貴州遵義563003；2.黔南州人民醫院檢驗科，貴州都勻558000）

目的觀察重組質粒pαACP-HSP70在晶狀體組織和非晶狀體組織中的表達情況，探討重組質粒pαACPHSP70的特異性表達。方法以晶狀體組織作為A組，肺小細胞癌細胞A549、肝癌細胞7402等非晶狀體組織作為B組，采用陽離子脂質體轉染法將pCMV-HSP70質粒、pαACP-HSP70質粒導入A、B組后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。結果轉染pCMV-HSP70質粒到A、B組24 h后發現，兩組均有綠色熒光；另外，轉染pαACP-HSP70質粒24 h后僅在A組能觀察到綠色熒光。結論重組質粒pαACP-HSP70不能在非晶狀體組織表達，僅能在晶狀體上皮細胞表達，具有組織特異性。

晶體；α晶體蛋白A鏈；HSP70熱休克蛋白質類；綠色熒光蛋白質類；特異性

白內障作為首位致盲疾病，其導致視力障礙給白內障患者的生活質量帶來極大的影響。手術治療為白內障患者提供了最終治療的有效手段，但手術治療會給患者帶來巨大的經濟負擔和風險及發生術后并發癥［1］。因此，研究和發現新的預防、延緩白內障的非手術方法和措施具有顯著意義。隨著分子生物學技術的發展，基因治療疾病引起人們的重視，通過導入外源基因來防治白內障的可行性處在研究階段。目前，外源基因表達主要應用巨細胞病毒（CMV）啟動子，CMV啟動子雖然高效，但外源基因表達沒有細胞特異性［2］。基因治療所需解決的首要問題是外源基因的特異性表達，一方面增強對特定靶點的調控，另一方面減少對非特定靶點的干擾。組織特異性啟動子的引入能夠增強外源基因的特異性表達。本課題組前期成功構建特異性啟動子αA晶體蛋白基因與熱休克蛋白70（HSP70）基因片段重組質粒［3］，本研究繼續深入研究重組質粒pαACP-HSP70是否具有組織特異性，為在白內障的基因防治中提供更多的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物為6～8周SD大鼠，購于第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，動物合格證：SCXK（渝2012-0005）；肝癌7402細胞、肺小細胞癌A549細胞購自中國科學院上海細胞庫；pαACP-HSP70質粒、pCMVHSP70質粒（由本教研室構建）；多價陽離子脂質體（LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司）；D-（+）-半乳糖（美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1晶狀體組織（A組）培養和轉染將SD大鼠以頸椎脫臼法處死，立即取出眼球，無菌操作暴露完整晶狀體，將其取出放入DMEM低糖培養基中（含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和20%胎牛血清），37℃5% CO2條件下培養8 h后，觀察晶狀體組織的情況，選取未受傷保持透明的晶狀體組織納入實驗。換用DMEM低糖培養基（無抗生素無血清），各組分別加入pCMVHSP70質粒、pαACP-HSP70質粒（用LipofectamineTM2000包裹，質粒質量為4 μg，混合質粒，混合物體積為100 μL），轉染過程按操作說明書進行，37℃5%CO2條件下培養24 h后行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光蛋白（EGFP）表達。

1.2.2非晶狀體組織（B組）培養和轉染將肺小細胞癌 A549細胞（B1組）、肝癌7402細胞（B2組）在10% FBS 1640培養基，37℃5%CO2培養箱內培養取對數生長期的細胞以1×106mL-1接種于六孔板中，待細胞生長接近80%～90%融合時，用 LipofectamineTM2000包裹pCMV-HSP70質粒、pαACP-HSP70質粒，轉染過程按操作說明書進行，于瞬時轉染后培養24 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞有無綠色熒光。

2　結　果

2.1A組轉染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70質粒24 h后冰凍切片熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡下觀察A組晶狀體組織轉染后冰凍切片的熒光變化如圖1所示。pCMV-HSP70質粒組和pαACP-HSP70質粒組均觀察到明顯EGFP表達（圖1a、b）；各組明場下均可見清晰晶狀體上皮結構（圖1c、d）。

圖1　A組轉染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70質粒24 h后冰凍切片熒光顯微圖（100×）

2.2B組轉染質粒24 h后熒光顯微鏡觀察

2.2.1熒光顯微鏡下觀察pCMV-HSP70質粒轉染B1、B2組24 h后可見綠色熒光，如圖2所示。

圖2　B組轉染pCMV-HSP70質粒24 h后熒光顯微圖（100×）

2.2.2熒光顯微鏡下觀察pαACP-HSP70質粒轉染B1、B2組24 h后均無綠色熒光，如圖3所示。

圖3　B組轉染pαACP-HSP70質粒24 h后熒光顯微圖（100×）

3　討　論

基因治療是將外源基因導入靶細胞并在靶細胞內表達，產生所需要的產物，對特定的靶點進行調控，從而達到治療疾病的目的。基因表達的組織特異性是受基因表達調控元件和細胞內調控蛋白所決定，因此，可以利用組織特異性啟動子在一定器官或組織部位增加區域目的基因的表達量，減少目的基因對靶外組織產生毒性反應。有研究結果顯示，利用可誘導的啟動子能夠調節基因治療中目的基因的表達［4］。楊加偉等［5-6］利用馬鈴薯塊莖特異性啟動子、馬鈴薯葉片特異性啟動子在塊莖、葉片等組織獲得高表達重組蛋白。

Massey等［7］研究表明，外源基因導入眼內后，可檢測到晶狀體內有相應蛋白表達。本課題組在前期的研究中，已成功將特異性啟動子αA晶體蛋白基因與HSP70基因片段成功構建為融合質粒［3］。有研究發現，HSP對細胞上皮的完整性有保護作用，可避免應激因子的損傷［8］。HSP70為熱休克蛋白家族重要成員，晶狀體中HSP70的表達水平升高有利于穩定晶狀體蛋白質的正確構象及晶狀體的透明性，從而延緩和減輕白內障的發生［9-10］。αA晶體蛋白是晶狀體細胞質中重要結構蛋白，已有研究證實，αA晶體蛋白僅局限在晶狀體內表達，其他組織僅有少量被發現［11］。本課題組前期研究中，將pαACPHSP70質粒導入晶狀體組織中，利用晶狀體上皮細胞內的基因調控蛋白進行表達，能夠定向使晶狀體上皮細胞內的HSP70含量增高，起到防治白內障的作用［12］，但該重組質粒是否具有組織特異性還未知，因此進行以上研究。

pαACP-HSP70質粒與pCMV-HSP70質粒結構相同的是均含有內部核糖體進入位點序列（IRES）［13-14］和增強型EGFP基因編碼區，IRES能夠增強目的基因翻譯水平的表達，使外源基因和EGFP基因同步表達，EGFP基因編碼區可表達EGFP，可以通過熒光顯微鏡觀察轉染效率。pαACP-HSP70質粒與pCMV-HSP70質粒結構不同的是pCMV-HSP70質粒啟動子為廣譜啟動子CMV，可表達于廣泛的組織，而pαACP-HSP70質粒啟動子為特異性啟動子——αA晶體蛋白基因啟動子，僅表達于晶狀體上皮細胞。因此，本實驗用熒光顯微鏡定性觀察到轉染pαACP-HSP70質粒24 h后晶狀體上皮有綠色熒光，肺小細胞癌A549細胞、肝癌7402細胞觀察無綠色熒光；轉染pCMV-HSP70質粒24 h后晶狀體上皮、肺小細胞癌A549細胞、肝癌7402細胞均有綠色熒光。提示重組pαACP-HSP70質粒具有組織特異性，能特異性表達于晶狀體組織，不表達于非晶狀體組織。但該質粒轉染效率、目的基因在靶器官內表達水平等問題有待進一步研究。

［1］黃家林，劉斌，朱增欽，等.發展中國家白內障手術的現狀［J］.國際眼科雜志，2013，13（6）：1142-1146.

［2］Harms JS，Eakle KA，Kuo LS，et al.Comparison of bovine leukemia virus （BLV）and CMV promoter-driven reporter gene expression in BLV-infected and non-infected cells［J］.Genet Vaccines Ther，2004，2（1）：11.

［3］姜婧怡，葛正龍.αA晶體蛋白基因啟動子與-HSP70融合基因表達載體的構建及鑒定［J］.遵義醫學院學報，2013，36（1）：13-20.

［4］ Arancibia-Cárcamo CV，Oral HB，Haskard DO，et al.Lipoadenofectionmediated gene delivery to the corneal endothelium：prospects for modulating graft rejection［J］.Transplantation，1998，65（1）：62-67.

［5］楊加偉，李偉，葛正龍.馬鈴薯塊莖特異性啟動子克隆及其驅動的hIL12表達載體構建［J］.遵義醫學院學報，2014，37（4）：387-392.

［6］楊加偉，程小玲，葛正龍.馬鈴薯葉片特異性啟動子克隆分析及其驅動的人白細胞介素-12表達載體構建［J］.基因組學與應用生物學，2014，33（4）：875-881.

［7］Massey AJ，Williamson DS，Browne H，et al.A novel，small molecule inhibitor of Hsc70/Hsp70 potentiates Hsp90 inhibitor induced apoptosis in HCT116 colon carcinoma cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，66（3）：535-545.

［8］Horowitz M，Robinson SD.Heat shock proteins and the heat shock response during hyperthermia and its modulation by altered physiological conditions［J］.Prog Brain Res，2007，162：433-446.

［9］周浩，褚仁遠，周行濤，等.晶狀體囊膜HSP70的表達與年齡相關性白內障［J］.眼科研究，2007，25（1）：37-39.

［10］李桂榮，周鴻雁，張文松.熱休克蛋白HSP27和HSP70在老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中表達及其意義［J］.中國實驗診斷學，2011，15（6）：1048-1050.

［11］Kato K，Shinohara H，Kurobe N，et al.Immunoreactive alpha A crystallin in rat non-lenticular tissues detected with a sensitiveimmunoassay method［J］. Biochim Biophys Acta，1991，1080（2）：173-180.

［12］張子萍，葛正龍.αA晶體蛋白基因啟動子與HSP70融合基因對大鼠半乳糖性白內障的抑制作用［J］.遵義醫學院學報，2014，37（3）：290-294.

［13］安懷杰，俞煒源，孫志偉.內部核糖體進入位點及其研究進展［J］.生物技術通訊，2007，18（4）：663-666.

［14］盧杰，張珈敏，林美娟，等.RNA病毒翻譯調控元件——內部核糖體進入位點（IRES）［J］.中國生物化學與分子生物學報，2007，23（7）：513-518.

Research on specific expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70*

Yang Minghui1，Zhao Xuefa2，Ge Zhenglong1△（1.Teaching and Researching Section of Biochemistry and Molecular Biology，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Clinical Laboratory，Qiannan Prefecture People′s Hospital，Duyun，Guizhou 558000，China）

ObjectiveTo observe the expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70 in the lens and non-lens tissues for investigating its specific expression.MethodsThe lens tissue was taken as the group A and the non-lens tissue of small cell lung cancer A549 cells and liver cancer 7402 cells as the group B.pCMV-HSP70 and pαACP-HSP70 plasmids were transfected into the group A and B by adopting the cationic lipofectin transfection method.The expression of enhanced green fluorescent protein produced in the two groups was observed by fluorescence microscope.ResultsAfter 24 h of pCMV-HSP70 plasmid transfection into the group A and B，the green fluorescence could be found in the two groups，however，after transfecting pαACPHSP70 plasmid，the green fluorescence could be found only in the group A.ConclusionThe pαACP-HSP70 recombination plasmid can not be expressed in non-lens tissue and only expressed in the lens epithelial cells with the tissue specificity.

Lens，crystalline；Alpha-crystallin A chain；HSP70 heat-shock proteins；Green fluorescent proteins；Specificity

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.005

A

1009-5519（2016）05-0651-03

貴州省優秀科技教育人才省長專項基金資助項目（黔省專合字［2009］47號）。

楊名慧（1986-），在讀碩士研究生，主要從事生物技術應用方面的研究。

△，E-mail：zlongge@hotmail.com。

（2015-12-01）