鏈球菌噬菌體的分離及其研究

■ 秦生巨戚太海張連水羅霞

（1南京巨豹生物工程有限公司 2滄州旺發生物技術研究所有限公司 3中國水產科學研究院珠江水產研究所）

鏈球菌噬菌體的分離及其研究

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（1南京巨豹生物工程有限公司 2滄州旺發生物技術研究所有限公司 3中國水產科學研究院珠江水產研究所）

噬菌體是一類細菌特異性的病毒，它有典型的病毒形態和結構。噬菌體對宿主有高度的特異性。噬菌體的作用方式，是以尾鞘吸附到宿主細胞特定的受點上，向菌體內注射RNA，并在菌體內復制子代，最終溶解宿主的方式，釋放子代。噬菌體不能在停止新陳代謝的宿主內生長繁殖。

羅非魚，是世界水產業的重點科研培養的淡水養殖魚類，且被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。通常生活于淡水中，也能生活于不同鹽份含量的咸水中，也可以存活于湖，河，池塘的淺水中。它有很強的適應能力，在面積狹小之水域中亦能繁殖，甚至在水稻田里能夠生長，且對溶氧較少之水有極強之適應性。絕大部分羅非魚是雜食性，常吃水中植物和碎物。

鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見的細菌，廣泛存在于自然界和人及動物糞便，健康人鼻咽部，大多數不致病。醫學上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌等。引起人類的疾病主要有化膿性炎癥、毒素性疾病和超敏反應性疾病等。

羅非魚鏈球菌病是2009年發生在廣東、廣西、海南3省的一種魚類疾病。網箱和池塘養殖的羅非魚均有此病的發生，主要危害親魚和100g以上的幼魚和成魚；流行高發期為5～9月份；流行水溫為25℃～37℃，在水溫32℃以上容易發病，且傳染性強，發病率達20%～30%，發病魚的死亡率可達80%以上。

表1 不同溫度對鏈球菌噬菌體形成噬菌斑活力的影響

表2 3株噬菌體于不同來源的鏈球菌株上形成噬菌斑能力的測定

表3 不同保存方法對噬菌體HN48/SS130920存活時間的影響

近年來國內許多同行都在探索羅非魚鏈球菌病的防治方法，但國內外尚未發現用噬菌體防治羅非魚鏈球菌病的報導。2015年我們在海南省做了羅非魚養殖水體及羅非魚體內鏈球菌噬菌體的分離檢測。本文是對此次分離、純化的鏈球菌噬菌體的初步研究結果的報導。

1 材料與方法

1.1 培養基

胨肉膏液：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，加蒸餾水到1,000mL，調整pH到7.4。固體培養基：上述胨肉膏液加1.2%瓊脂粉。半固體培養基：上述胨肉膏液加0.7%瓊脂粉。軟瓊脂培養基：上述胨肉膏液加0.3%瓊脂粉。0.85%生理鹽水：NaCl8.5g，加蒸餾水到1,000mL，調整pH到7.4。

1.2 宿主菌株

用于檢查、分離、培養鏈球菌噬菌體及其檢查其宿主范圍的鏈球菌株為本公司及中國水產科學研究院珠江水產研究所保存者。

1.3 檢測樣本

用于檢測的水體和羅非魚樣本來自海南省海口市郊區桂林洋和文昌市大致坡。

1.4 噬菌體噬菌斑的檢測、計數

幼稚宿主菌懸液的制備：將保存獲得的鏈球菌在胨肉膏固體培養基平板上劃線分離，于37℃培養18～24h，取典型的菌落圖片，革蘭氏染色鏡檢，可見典型的鏈球菌形態。取典型的菌落接種到胨肉膏液中，于37℃培養4～6h備用。雙層瓊脂法。

1.5 鏈球菌噬菌體的檢出、分離、純化與培養

采集的新鮮水樣450mL，加10倍濃縮的胨肉膏液50mL，加幼稚宿主菌懸液2mL于37℃培養過夜。采集的羅非魚樣品取其魚的內臟10～15g加到500mL的胨肉膏液中，同時加2mL幼稚宿主菌懸液，于37℃培養過夜。取培養過夜的樣品上清液10mL，12,000prm取上清液，于56℃水浴培養1h，取上清液0.5mL以鏈球菌幼稚菌懸液0.2mL為宿主，用雙層瓊脂平板法檢查噬菌斑的形成。有透明的噬菌斑的形成即可判定有噬菌體的檢出為陽性，未見有透明的噬菌斑的形成即可判定噬菌體的檢出為陰性。分離、純化、培養。

1.6 鏈球菌噬菌體的保存

圖1 噬菌斑

將分離獲得的噬菌體H N 4 8/SS130920制成上清液，用以下不同的方法和條件保存。

胨肉膏液：于100mL胨肉膏液中加噬菌體上清液2mL；軟瓊脂：于10mL胨肉膏軟瓊脂中加噬菌體上清液0.5mL；半固體瓊脂：于10mL胨肉膏半固體瓊脂中加噬菌體上清液0.5mL；于自來水液中加含量大約為105/pfu噬菌體。以上4種方法都同時平行做2組，一組加鏈球菌幼稚菌液，使其濃度大約為106/cfu。另一組不加鏈球菌幼稚菌液。4種方法每組做3管。然后加有鏈球菌幼稚菌液和不加鏈球菌幼稚菌液的保藏物，分別放置于4℃、37℃及室溫（南京市的2015年9月到2016年8月）保存，并檢查存活時間。

2 結果

2.1 噬菌體的檢出、分離結果及菌株的檢查

2015年7～9月及2016年9～10月于海南省文昌市和海口市6處采集海、淡水樣79份，羅非魚樣品3份，共計82份樣品。其中檢出在鏈球菌宿主上能形成噬菌斑的5份（3.79%），其中淡水檢查3份，海水2份，羅非魚樣品沒有檢出噬菌斑。有5份陽性結果經噬菌斑純化得到3株（HN48/SS130920、HN58/SS130920、HN74/SS130920、）無雜菌生長的噬菌體株，對其進一步檢查。

其結果為：在胨肉膏雙層瓊脂培養基平板上，于37℃培養12～18小時形成透明的噬菌斑，噬菌斑的直徑1～3mm（見圖1）；可使濃厚的宿主菌胨肉膏懸液（20億/mL）4～6h后裂解透明。

2.2 溫度對噬菌斑形成的影響

檢查了不同溫度對3株噬菌體于胨肉膏雙層瓊脂培養基平板上形成噬菌斑活力的影響，25℃～40℃16h均可形成噬菌斑。但從已形成噬菌斑活力來看35℃更為合適，20℃及以下、45℃及以上未見噬菌斑的形成。結果見表1。

2.3 于不同的鏈球菌株上形成噬菌斑能力的測定

檢查了3株噬菌體于胨肉膏雙層瓊脂培養基平板上對不同來源的鏈球菌形成噬菌斑的能力（宿主范圍）。每平板接種噬菌體上清液0.5mL，鏈球菌宿主菌幼稚培養液0.2mL，37℃培養16h觀察結果。結果見表2。

2.4 保存方法及存活時間

檢查了噬菌體HN48/SS130920在胨肉膏液、軟瓊脂、半固體瓊脂、自來水中的存活時間；同時檢查了加有宿主鏈球菌幼稚菌液和不加宿主鏈球菌幼稚菌液對其保存的影響；也觀察了在4℃、37℃及室溫（南京市的2015年9月到2016年8月）鏈球菌噬菌體存活時間。結果見表3。

3 討論

根據噬菌體株的特性這是一類以鏈球菌為宿主的鏈球菌噬菌體。據此次調查，養殖羅非魚的海、淡水體都可分離到此類噬菌體的存在，但含量有限。

噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應噬菌體的存在。在人和動物的排泄物或污染的井水、河水中，常含有噬菌體。鏈球菌噬菌體在污染的水源中也不難找到其宿主，尤其是水生物的養殖水源中。25℃～40℃都有裂解活力。在加有宿主菌的胨肉膏液中4℃環境中保存1年以上仍可檢出。因此推測在自然環境水體中將可繁衍生存。其存在對鏈球菌，尤其是羅非魚鏈球菌病的病原菌在自然界的生物控制中所起的作用值得進一步探討。（參考文獻略）