廢水處理劑ABR Hydrocarbon對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)的研究

杜國(guó)豐

(營(yíng)口理工學(xué)院化學(xué)工程系，遼寧　營(yíng)口　115014)

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廢水處理劑ABR Hydrocarbon對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)的研究

杜國(guó)豐

(營(yíng)口理工學(xué)院化學(xué)工程系，遼寧營(yíng)口115014)

對(duì)廢水處理劑ABR Hydrocarbon的應(yīng)用條件及其對(duì)石油污染土壤的微生物修復(fù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：廢水處理劑ABR Hydrocarbon的最佳發(fā)酵溫度為40 ℃、最佳發(fā)酵pH為7.0，發(fā)酵液中有表面活性物質(zhì)產(chǎn)生，土壤中微生物的脫氫酶活性與石油烴降解率之間存在較好的相關(guān)性。連續(xù)培養(yǎng)32天，石油烴的降解率達(dá)到了33.4%，土壤微生物脫氫酶活性為83.0 μg/(g·h)。試驗(yàn)表明廢水處理劑ABR Hydrocarbon具有較好的石油烴降解能力。

廢水處理劑ABR Hydrocarbon；生物修復(fù)；降解率；脫氫酶

石油在開采、運(yùn)輸、處理過程中產(chǎn)生的落地油和油泥是油田土壤污染的主要來源。石油的黏著力強(qiáng)、乳化能力低，進(jìn)入土壤會(huì)改變土壤表層的有機(jī)質(zhì)組成和結(jié)構(gòu),降低土壤通透性，導(dǎo)致土壤高度板結(jié)，氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞困難；石油中的苯系物BTEXA和多環(huán)芳烴具有致癌、致畸、致突變[1-2]等作用,并能通過食物鏈在動(dòng)、植物及微生物體內(nèi)逐漸富集，使得植物及微生物難以生存，嚴(yán)重影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)[3]。

對(duì)石油污染土壤的治理，傳統(tǒng)的物理化學(xué)處理方法會(huì)造成二次污染，同時(shí)處理成本高。生物修復(fù)克服了這些缺點(diǎn)，近年來已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外環(huán)境治理技術(shù)的研究熱點(diǎn)。微生物修復(fù)是利用微生物將石油中有毒的有機(jī)物組分分解或降解成為低毒或無毒的物質(zhì)，是修復(fù)石油污染的有效技術(shù)[4]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究大部分集中在石油降解菌株的篩選、石油降解機(jī)理以及土壤修復(fù)工藝方面，很少涉及復(fù)合菌劑對(duì)石油污染土壤的研究[5]。然而石油組分復(fù)雜且具有難降解性，僅靠單一菌種無法完全降解，必須有多種微生物的聯(lián)合參與。

廢水處理劑ABR Hydrocarbon是諾維信公司研制的一種混合菌群制劑，其中所含的菌群都是來自于自然界，能降解包括輕度蒸餾油及重度分餾油等組分的高濃度污染物，工業(yè)上常用來處理廢水。本文以石油為典型污染物，通過室內(nèi)試驗(yàn)，研究ABR Hydrocarbon對(duì)石油污染土壤的微生物修復(fù)，以期為大面積高效修復(fù)石油污染土壤提供理論依據(jù)，為推動(dòng)高效復(fù)合菌劑應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)提供技術(shù)支持。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1試劑及材料

甲苯、氯化三苯基四氮唑(TTC)、甲醛、丙酮等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

諾碧清廢水處理劑ABR Hydrocarbon，諾維信生物技術(shù)公司；土壤樣品，采自遼河油田金馬采油二區(qū)采油井周圍，隨機(jī)取樣，含油率20%左右。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉5，pH 7.2；無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl2，K2HPO41.5，KH2PO43，MgSO4,0.1，CaCl20.01，Na2EDTA 0.01，pH 7.5。

1.2儀器

BJ-2CD型超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；KZD-C型雙層空氣恒溫振蕩器，金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C型精密pH計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；GZX-9146MBE 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；JYW-200A全自動(dòng)液晶顯示表/界面張力儀，承德金和儀器制造有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌劑ABR Hydrocarbon生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將1 g ABR Hydrocarbon粉末狀菌劑置于100 mL無菌水中，37 ℃條件下活化0.5 h，取1 mL活化液接種到100 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。在250 mL錐形瓶?jī)?nèi)裝100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，按5%的接種量接入菌劑的LB發(fā)酵培養(yǎng)液，于37 ℃，150 rpm振蕩培養(yǎng)36 h，分別在2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36 h取樣測(cè)定生長(zhǎng)曲線，以600 nm處吸光度(A)表示，設(shè)3個(gè)平行樣，繪制菌劑ABR Hydrocarbon的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2不同溫度下菌劑ABR Hydrocarbon菌液濃度的測(cè)定

取1.3.1中的發(fā)酵液按5%的接種量接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下，150 rpm振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定菌液濃度，以600 nm處吸光度(A)表示，設(shè)3個(gè)平行樣，考察溫度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon生長(zhǎng)活力的影響。

1.3.3不同酸堿度下菌劑ABR Hydrocarbon菌液濃度的測(cè)定

取1.3.1中的發(fā)酵液按5%的接種量接入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別在pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0條件下，150 rpm振蕩培養(yǎng)24 h，取樣測(cè)定菌液濃度，以600 nm處吸光度(A)表示，設(shè)3個(gè)平行樣，考察酸堿度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon生長(zhǎng)活力的影響。

1.3.4模擬原位生物修復(fù)試驗(yàn)

取1.3.1中發(fā)酵液，按5%的添加量與土壤樣品混合，同時(shí)設(shè)一組未加菌液的空白組，于自然條件下培養(yǎng)，定期翻動(dòng)土壤保持土壤的好氧狀態(tài)，隔2天加水一次，保持土壤含水率在20%左右。含水率采用烘干失重法[6]測(cè)定，采用四分法取土壤樣品10 g置于燒杯，稱總質(zhì)量后于105 ℃烘箱中烘干，待冷卻至室溫稱總質(zhì)量，計(jì)算含水率公式為：

式中：W——含水率，%

m1——烘干前土壤樣品與燒杯總質(zhì)量，g

m2——烘干后土壤樣品與燒杯總質(zhì)量，g

1.3.5土壤中石油含量的測(cè)定

土壤中石油含量的測(cè)定采用比色法[7]。取土壤樣品10 g，加入50 mL甲苯萃取殘余石油，測(cè)定萃取液在420 nm的吸光度值，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，石油降解率以降解前后石油質(zhì)量差值與降解前石油質(zhì)量的比值表示。由于石油揮發(fā)而造成的測(cè)量誤差可以忽略。

1.3.6土壤脫氫酶活性的測(cè)定

監(jiān)測(cè)時(shí)間從2017年3月9日晚20:05開始檢測(cè),到2017年4月5日晚20:00結(jié)束,共采集27 d數(shù)據(jù),包含日期、時(shí)間、碳濃度、溫度等數(shù)據(jù)。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法[8]測(cè)定土壤脫氫酶活性。用四分法取試驗(yàn)土壤樣品2 g置于錐形瓶中，加2 mL 0.4% TTC液，于37℃避光培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后加0.5 mL甲醛終止反應(yīng)，再加10 mL丙酮振蕩提取，經(jīng)脫脂棉過濾，取上清液于485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣。將1 g干土1 h內(nèi)產(chǎn)生1 μg三苯基甲膳(TF)的量作為一個(gè)酶活力單位 [μg/(g·h)]。

2　結(jié)果與討論

2.1菌劑ABR Hydrocarbon生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果

菌劑ABR Hydrocarbon生長(zhǎng)延滯期較短，菌劑內(nèi)的細(xì)菌之間存在較好的協(xié)同作用，在8 h以后即可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24 h以后達(dá)到穩(wěn)定期，測(cè)定此時(shí)發(fā)酵液在600 nm下的吸光度為1.579，可見24 h為菌劑ABR Hydrocarbon的最佳培養(yǎng)時(shí)間(圖1)，后續(xù)溫度、酸堿度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵影響的試驗(yàn)中采用24 h作為發(fā)酵時(shí)間。

圖1　菌劑ABR Hydrocarbon的生長(zhǎng)曲線

2.2溫度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵的影響

活化的菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵液，利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基在5～50 ℃溫度區(qū)間振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，各溫度下發(fā)酵液在600 nm下的吸光度及表面張力見圖2。

圖2　溫度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨溫度的升高，菌劑ABR Hydrocarbon的發(fā)酵活力逐漸升高，與此同時(shí)表面張力呈下降趨勢(shì)。溫度影響菌劑ABR Hydrocarbon的發(fā)酵活力和表面張力，從5 ℃開始，溫度每升高10 ℃，發(fā)酵液的濃度增大一倍左右，至40 ℃，發(fā)酵活力達(dá)到最佳狀態(tài)，此時(shí)菌液的OD600為1.624；超過40 ℃時(shí)溫度再升高，發(fā)酵活力逐漸下降，至50 ℃時(shí)發(fā)酵活力下降已很明顯，與15 ℃時(shí)相當(dāng)。發(fā)酵液表面張力與菌液濃度之間有很好的負(fù)相關(guān)性，當(dāng)溫度達(dá)40 ℃時(shí)，發(fā)酵液的表面張力已降至25.24 mN/m，表明菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵產(chǎn)生了表面活性物質(zhì)，而表面活性劑對(duì)于石油有很好的乳化作用，這為菌劑ABR Hydrocarbon應(yīng)用于石油污染土壤的生物修復(fù)提供了可能。

2.3酸堿度對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵的影響

圖3　pH對(duì)菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵的影響

由圖3可知，菌劑ABR Hydrocarbon在pH 5.0～9.0區(qū)間均能生長(zhǎng)，只是在pH低于6.0時(shí)發(fā)酵活力較低，在pH 7.0中性條件下菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵活力達(dá)到最大，菌液的OD600為1.701，與此同時(shí)發(fā)酵液的表面張力為25.14 mN/m。不同pH下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液的表面張力與濃度之間存在較好的負(fù)相關(guān)性。菌劑ABR Hydrocarbon的發(fā)酵pH條件與土壤的自然酸堿性相當(dāng)，這為菌劑ABR Hydrocarbon應(yīng)用于土壤修復(fù)提供了方便。

2.4土壤原位生物修復(fù)石油烴降解結(jié)果

圖4　不同處理組的石油降解率、土壤脫氫酶活性

加菌劑ABR Hydrocarbon處理組與空白組石油降解情況見圖4。由圖4可見，空白組即自然體系中土著微生物對(duì)石油烴的降解率較低，第32天時(shí)僅為7.5%，添加菌劑ABR Hydrocarbon對(duì)石油烴的降解效果較好。經(jīng)過短暫的適應(yīng)階段從第4天開始，菌劑的石油降解效果開始明顯好于空白組(土著微生物)。菌劑ABR Hydrocarbon內(nèi)的細(xì)菌可以產(chǎn)生生物表面活性劑乳化石油，適量的表面活性劑對(duì)微生物的石油降解有促進(jìn)作用[9]，可以提高微生物與石油的接觸度，從而提高石油的生物可利用性[10]；也可以產(chǎn)生大量胞外酶[11]，促進(jìn)其對(duì)石油烴中難降解物質(zhì)以及細(xì)菌降解所產(chǎn)生的高分子量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜代謝中間產(chǎn)物的降解[12]。菌劑ABR Hydrocarbon在石油烴降解方面表現(xiàn)出極強(qiáng)的，連續(xù)培養(yǎng)32天后，菌劑ABR Hydrocarbon石油烴的降解率達(dá)到33.4%，比空白組高345%。

無論是菌劑ABR Hydrocarbon組還是空白組，石油烴降解速率均為前16天最快，這可能是因?yàn)樯锝到馑俣扰c石油類混合物中烴類化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。前期，微生物首先利用易降解組分，隨著易降解組分的減少，剩下的大分子難降解的組分在菌劑ABR Hydrocarbon內(nèi)混合菌的協(xié)同作用下，也開始緩慢降解，這主要表現(xiàn)在降解后期降解率上升的幅度不大。

2.5土壤脫氫酶測(cè)定結(jié)果

微生物體內(nèi)含有的脫氫酶使得石油烴的氫原子活化并傳遞給特定的氫受體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化。在許多情況下微生物對(duì)石油污染物的降解或轉(zhuǎn)化從脫氫開始，因此可以利用脫氫酶的活性反映石油降解微生物的活性[13]。加菌劑ABR Hydrocarbon處理組與空白組對(duì)土壤中微生物脫氫酶活性的影響見圖4。

由圖4中可以看出，土壤中微生物脫氫酶的活性與石油烴的降解率呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。加菌劑ABR Hydrocarbon處理組的脫氫酶活性在第16天達(dá)到80.3 μg/(g·h)，第32天為83.0 μg/(g·h)，大大高于空白組的脫氫酶活性，進(jìn)一步證實(shí)了菌劑ABR Hydrocarbon在降解石油污染物上的高效性。第16在后，脫氫酶活性增幅較小，這可能與后期難降解的石油烴組分很少能被微生物利用的原因[14]。

3　結(jié)　論

筆者以石油為典型污染物，通過室內(nèi)培養(yǎng)及其對(duì)石油污染土壤的微生物修復(fù)試驗(yàn)，我們得出：廢水處理劑ABR Hydrocarbon利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵有表面活性物質(zhì)產(chǎn)生，在5～50 ℃溫度區(qū)間，每升高10 ℃，發(fā)酵液的濃度增大一倍左右，并且在40 ℃時(shí)發(fā)酵活力達(dá)到最大，；在土壤自然的酸堿度條件下(pH 6.0～9.0)均能很好的生長(zhǎng)，pH 7.0中性條件下菌劑ABR Hydrocarbon發(fā)酵活力最大。在模擬原位生物修復(fù)試驗(yàn)中，廢水處理劑ABR Hydrocarbon對(duì)石油污染土壤中石油烴的降解表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解能力，與此同時(shí)土壤中微生物的脫氫酶活性與石油降解率之間存在較好的相關(guān)性，連續(xù)培養(yǎng)32天后對(duì)石油烴的降解率達(dá)到了33.4%，廢水處理劑 ABR Hydrocarbon處理組的脫氫酶活性為83.0 μg/(g·h)。

本研究初步證實(shí)了廢水處理劑 ABR Hydrocarbon用于生物修復(fù)治理石油污染土壤的可行性，后續(xù)工作將深入研究廢水處理劑 ABR Hydrocarbon內(nèi)各個(gè)細(xì)菌之間相互作用的機(jī)制以及修復(fù)過程的規(guī)模化。

石油烴降解菌劑的應(yīng)用受外界因素的影響很大，溫度、土壤濕度、鹽堿度、光照、空氣流通、土著微生物的干預(yù)都會(huì)或多或少的影響到菌劑對(duì)石油烴的降解能力[15]。因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需要研究菌劑的最佳使用方法，以期最大效力的發(fā)揮菌劑的作用。

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Study on the Bioremediation of Petroleum Contaminated Soil by Wastewater Treatment Agent ABR Hydrocarbon

DUGuo-feng

(Department of Chemical Engineering, Yingkou Institute of Technology，Liaoning Yingkou 115014, China)

The application conditions of wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon and the microbial remediation of petroleum contaminated soil were studied. The results showed that the optimal fermentation temperature of wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon was 40 ℃, and the optimal fermentation pH was 7.0, surfactants produced in the fermentation liquid, there was a good correlation between the activity of dehydrogenase activity and the degradation rate of petroleum hydrocarbons in soil. After continuous cultivation for 32 days, petroleum hydrocarbon degradation rate reached 33.4%, soil microbial dehydrogenase activity was 83.0 μg/(g·h). The experiments showed that the wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon had good petroleum hydrocarbon degradation ability.

wastewater treatment agent ABR Hydrocarbon; bioremediation; degradation rate; dehydrogenase

杜國(guó)豐(1984-)，男，碩士，營(yíng)口理工學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向：微生物與環(huán)境工程。E-mail:duguofeng885624@163.com

Q939.97

A

1001-9677(2016)07-0107-04