鹿茸活性肽的分離提純及成分測定

楊陽

（黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱　150081）

鹿茸活性肽的分離提純及成分測定

楊陽

（黑龍江省野生動物研究所，哈爾濱150081）

采用醇沉法、Sephadex G-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析法分離提純鹿茸活性肽，得到的鹿茸活性肽純度較高，為79.397%，分子量為3 000～3 200 Da，并含谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸等14種氨基酸。

鹿茸；活性肽；分離；提純

鹿茸中含有很多活性物質，傳統的加工方法易使鹿茸產品中的活性物質遭到破壞而不能被充分利用，因此采用科學的方法分離提純鹿茸活性肽成分，并對其進行性質分析，能夠提高鹿茸的利用率，促進我國珍貴藥材鹿茸的開發和利用。

1　試驗材料

梅花鹿二杠鮮茸（冷凍保存）；葡聚糖Sephadex G-25；TOYOPEARLGiga Cap s-650M；超低分子量Marker；乙酸—乙酸鈉（HAc-NaAc）；95%乙醇；醋酸—醋酸鈉緩沖溶液。

2　試驗方法

2.1鹿茸活性肽的粗提

取凍存（-18℃）的梅花鹿二杠鮮茸1 kg，冷凍切片，加入3000mL預先冷卻的200μmo1/L pH3.5的醋酸—醋酸鈉緩沖溶液，放置過夜。8 500 r/min離心20 min，取上清液，加入95%乙醇使其終濃度達到65%，4℃放置并攪拌，4 h后8 500 r/min離心20 min，取上清，在真空旋轉蒸發儀55℃中蒸發，回收乙醇，最終濃縮體積約為400 mL，得到鹿茸粗提物，-20℃保存備用。

2.2鹿茸活性肽的精提

通過查閱資料、預試驗，確定通過SephadexG-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析進行提純。

2.2.1Sephadex G-25層析

將溶脹好的Sephadex G-25裝入處理好的層析柱中（20mm×32cm），選用pH4.0，2mmol/L HAc-NaAc作為流動相，流速為1.5 mL/min，加入鹿茸粗提物5 mL，根據核酸蛋白檢測儀顯示的數值收集各峰，進行生物活性檢測，將免疫活性強的組份進行下一步層析。

2.2.2TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析

TOYOPEARL Giga Cap s-650M灌柱（20 mm ×32 cm）后，選用pH 3.6，5 mmol/L HAc-NaAc作為流動相，加入經Sephadex G-25純化后活性肽，5 mL（經分子量為1 200的透析袋透析濃縮），根據核酸蛋白檢測儀顯示的數值收集流穿峰，然后分別使用pH 4.0、濃度為0.5和1 mol/L HAc-NaAc溶液洗脫，并收集洗脫峰，進行生物活性檢測，收集免疫活性強的組份即為鹿茸活性肽的精提物。

2.3電泳檢測

進行SDS-PAGE分析，測定鹿茸活性肽的分子量。

2.4活性肽的氨基酸測定

采用氨基酸自動分析儀（柱后衍生法）測定活性肽的氨基酸組成。

2.5多肽純度的測定

采用haimagerTM2 200凝膠成像系統對電泳圖的條帶進行光密度掃描，測定純度。

3　試驗結果

3.1鹿茸活性肽的分離提純

經粗提、Sephadex G-25層析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M層析，及生物活性檢測，得出免疫活性強的組份即為鹿茸活性肽精提物。

3.2電泳檢測結果

使用TOYOPEARL Giga Cap s-650M陽離子交換填料的洗脫峰經電泳檢測（圖1）顯示：鹿茸多肽的電泳圖譜為一條帶，表明分離得到的鹿茸多肽已較純，與相應的Marker做對照，其分子量約為3 000～3 200 Da。

圖1　電泳檢測結果

3.3活性肽的氨基酸測定

從鹿茸的活性多肽中檢測出14種氨基酸（表1），主要有谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、精氨酸、亮氨酸等。

表1　鹿茸多肽的氨基酸含量及組成　g/100g

3.4多肽純度測定

用AlphaimagerTM2 200凝膠成像系統對電泳檢測結果中泳道2的條帶進行光密度掃描（圖2）顯示：泳道2中鹿茸多肽的純度為79.397%。

圖2　凝膠成像掃描圖譜

4討　論

電泳檢測結果為一條蛋白區帶，表明分離得到的鹿茸多肽已較純，與相應的Marker做對照分子量為3 000～3 200 Da，經AlphaimagerTM2 200凝膠成像系統掃描，純度為79.397%，從氨基酸組成成分看，提純的鹿茸多肽含谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸等14種氨基酸。

［1］宗穎，劉侗，王志穎.鹿茸多肽成分及其藥理作用研究［J］.吉林中醫藥，2013（11）:1135-1137.

［2］張微，張振秋，李峰，等.馬鹿茸多肽提取工藝研究［J］.中華中醫藥刊，2006（3）:630-632.

［3］趙玉紅，張立剛，張睿.鹿茸水浴性蛋白提取條件的優化及組分［J］.東北林業大學學報，2016（7）:120-124.

第1作者簡介：楊陽（1979-），女，碩士研究生，副研究員，主要從事野生動物藥理毒理及產品開發工作。

（責任編輯：李丹）

Antler Active Peptide Separation，Purification and Determination of Composition

YANGYang
（Wildlife Institute of Heilongjiang Province，Harbin150081）

By the methods of alcohol sink，Sephadex G-25 chromatography and TOYOPEARL Giga Cap s-650M chromatography separation and purification method of antlr Sexpeptide.；Antler active peptide was of high purity.Molecular weight is about 3 000-3 200 Da，The purity of 79.397%，lncluding 14 kinds of amino acids.

Antler；Active peptide；Separation；Purification

S825；Q516

C

1001-9499（2016）04-0077-02

2016-06-30