兩種顯色鑒定法在陰道致病假絲酵母菌鑒定中的應(yīng)用價值*

祁文瑾，李賽男，陳　卓，許妙玲

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.產(chǎn)科；2.婦科，昆明 650032)

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·經(jīng)驗交流·

兩種顯色鑒定法在陰道致病假絲酵母菌鑒定中的應(yīng)用價值*

祁文瑾1，李賽男1，陳卓1，許妙玲2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.產(chǎn)科；2.婦科，昆明 650032)

目的探討兩種顯色培養(yǎng)基在外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)致病菌種快速鑒定中的臨床應(yīng)用價值。方法以科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、安圖顯色培養(yǎng)基和VITEK 2酵母菌鑒定卡對來自VVC患者的致病假絲酵母菌進(jìn)行菌種分析，最終鑒定結(jié)果以VITEK系統(tǒng)為準(zhǔn)。結(jié)果兩種顯色培養(yǎng)基對243株外陰陰道假絲酵母菌病致病菌株的鑒定準(zhǔn)確率分別為94.7%和95.1%。其中，白假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率最高，為99.5%和98.6%，非白假絲酵母菌以光滑假絲酵母菌鑒定準(zhǔn)確率最高，克柔假絲酵母菌鑒定準(zhǔn)確率最低；白假絲酵母菌顯色鑒定的敏感性和特異性均在98.0%以上，非白假絲酵母菌鑒定的敏感性和特異性相對較低。結(jié)論兩種顯色培養(yǎng)基均適合于臨床VVC致病菌種的快速鑒別，但安圖顯色培養(yǎng)基更具臨床推廣價值；對非白假絲酵母菌致病患者，建議行VITEK鑒定以更好指導(dǎo)臨床用藥。

酵母菌數(shù)；培養(yǎng)基；陰道；假絲酵母菌病；外陰陰道；顯色培養(yǎng)基；菌種；鑒定

外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)是一種常見的外陰陰道感染性疾病，大約75%的婦女一生中至少有過一次外陰陰道假絲酵母菌感染，45%的婦女經(jīng)歷過兩次或兩次以上的感染[1-3]，對VVC致病假絲酵母菌的快速鑒定在臨床用藥的選擇中具有非常重要的意義。本研究采用3種方法對VVC陰道致病菌種進(jìn)行比較鑒定，以期能客觀評價兩種顯色培養(yǎng)基，特別是安圖顯色培養(yǎng)基在假絲酵母菌菌種快速鑒定中的應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料陰道致病假絲酵母菌菌株243株，均來自本院婦產(chǎn)科門診VVC和復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)患者。所有患者均不存在免疫相關(guān)性疾病及糖尿病等內(nèi)外科疾病，無長期使用抗生素史。收集標(biāo)本前1周禁止性交、盆浴、陰道檢查及局部上藥，采集時均以膀胱截石位于陰道后穹窿處收集白帶進(jìn)行假絲酵母菌鏡檢，見典型假絲酵母菌菌絲為鏡檢陽性。

1.2方法

1.2.1診斷標(biāo)準(zhǔn)VVC：有外陰瘙癢、白帶異常呈豆渣樣等典型VVC癥狀，且假絲酵母菌鏡檢、培養(yǎng)陽性。RVVC：一年內(nèi)有癥狀并經(jīng)真菌學(xué)證實的VVC發(fā)作4次或4次以上者。

1.2.2研究方法

1.2.2.1標(biāo)本處理將鏡檢陽性白帶接種于沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱24～48 h，有乳酪狀假絲酵母菌菌落生長為培養(yǎng)陽性，挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基保存，用于鑒定和后續(xù)試驗，定時轉(zhuǎn)種以保持菌株的活力。

1.2.2.2菌種鑒定以科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司生產(chǎn)，鄭州博賽公司分裝)、安圖顯色培養(yǎng)基(安圖生物)和VITEK 2酵母菌鑒定卡(法國-生物梅里埃公司)3種方法進(jìn)行上述分離、純化致病假絲酵母菌株的菌種鑒定。質(zhì)控菌株為白假絲酵母菌ATCC90028標(biāo)準(zhǔn)株，購自美國細(xì)胞典藏中心。

1.2.3結(jié)果判定顯色鑒定根據(jù)不同菌落在培養(yǎng)基上顏色的差異來確定菌種類型， VITEK 2則由系統(tǒng)自動分析得出菌種鑒定結(jié)果，最終鑒定結(jié)果以VITEK 2為準(zhǔn)。

1.2.3.1科瑪嘉培養(yǎng)基顯色鑒定顯色培養(yǎng)基上綠色、翠綠色菌落鑒定為白假絲酵母菌；紫色、淡紫色菌落鑒定為光滑假絲酵母菌；粉紅色菌落鑒定為克柔氏假絲酵母菌；藍(lán)灰色、鐵藍(lán)色菌落鑒定為熱帶假絲酵母菌；其他顏色鑒定為其他假絲酵母菌。

1.2.3.2安圖培養(yǎng)基顯色鑒定顯色培養(yǎng)基上綠色菌落鑒定為白假絲酵母菌；紫色、淡紫色菌落鑒定為克柔假絲酵母菌；白色菌落鑒定為光滑假絲酵母菌；灰色菌落鑒定為熱帶假絲酵母菌；其他顏色鑒定為其他假絲酵母菌。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1陰道致病白假絲酵母菌與非白假絲酵母菌構(gòu)成比243株VVC致病菌株中，經(jīng)VITIK2酵母鑒定卡鑒定確認(rèn)有白假絲酵母菌217株，非白假絲酵母菌26株。其中，VVC致病菌株159株，檢出白假絲酵母菌菌株141株(88.68%)，非白假絲酵母菌18株(11.32%)；RVVC致病菌株84株，檢出白假絲酵母菌76株(90.48%)，非白假絲酵母菌8株(9.52%)。兩者白假絲酵母菌構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.23種方法對陰道致病假絲酵母菌的鑒定結(jié)果比較安圖顯色培養(yǎng)基、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和VITEK鑒定獲得的白假絲酵母菌菌株分別為216、214和217株，均以白假絲酵母菌最為多見。以VITEK 2鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，安圖顯色培養(yǎng)基和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對243株VVC致病菌株的鑒定符合率分別為94.7%(229/243)和95.1%(230/243)。其中，白假絲酵母菌的鑒定符合率為99.5%(216/217)和98.6%(214/217)；光滑假絲酵母菌鑒定符合率為84.6%(11/13)和92.3%(11/12)；熱帶假絲酵母菌的鑒定符合率為66.7%(4/6)和85.7%(6/7)；克柔假絲酵母菌的鑒定符合率較低，僅為25.0%(2/8)和28.7%(2/7) 。3種方法鑒定的陰道致病假絲酵母菌不同菌種構(gòu)成比見表1。

2.3兩種顯色培養(yǎng)基用于4種主要菌種鑒定的敏感性與特異性經(jīng)與VITEK2鑒定結(jié)果對比，安圖顯色培養(yǎng)基鑒定為白假絲酵母菌的菌株有1株為熱帶假絲酵母菌，2株為圓球形假絲酵母菌；鑒定為光滑假絲酵母菌的有1株為白假絲酵母菌，2株為季也蒙假絲酵母菌，1株為熱帶假絲酵母菌，1株為其他假絲酵母菌；鑒定為克柔氏假絲酵母菌的有3株為光滑假絲酵母菌，1株為季也蒙假絲酵母菌，1株為近平滑假絲酵母菌，1株為熱帶假絲酵母菌；鑒定為熱帶假絲酵母菌的有1株為白假絲酵母菌。科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定為白假絲酵母菌的菌株有1株為熱帶假絲酵母菌；鑒定為光滑假絲酵母菌的有2株為白假絲酵母菌，2株為季也蒙假絲酵母菌；鑒定為克柔氏假絲酵母菌的有3株為光滑假絲酵母菌， 1株為近平滑假絲酵母菌，1株為其他假絲酵母菌；鑒定為熱帶假絲酵母菌的有2株為白假絲酵母菌。兩種顯色培養(yǎng)基對4種主要菌種鑒定的特異性、敏感性見表2。

表1　3種方法鑒定的陰道致病假絲酵母菌菌種比較[n(%)]

表2　兩種顯色培養(yǎng)基菌種鑒定的特異性和敏感性

3　討　論

假絲酵母菌是一種有孢子相和菌絲相的雙相菌，廣泛存在于自然界，是人體正常菌群構(gòu)成的一部分，它在正常健康人的皮膚、黏膜、口腔和陰道等部分均有存在。假絲酵母菌屬于機(jī)會致病菌，正常情況下假絲酵母菌為孢子相存在。在某些因素影響下，如肥胖、頻繁的陰道灌洗、多胎多產(chǎn)、多次人流、口服避孕藥、宮內(nèi)節(jié)育器的放置、糖尿病等，孢子相可轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相而引起臨床癥狀[4]。目前，國內(nèi)外大部分研究表明VVC的主要致病菌為白假絲酵母菌，但非白假絲酵母菌，尤其是光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌致病的比例逐年升高[5-6]，有學(xué)者認(rèn)為其原因可能與臨床抗真菌藥物不合理應(yīng)用有關(guān)，這種不合理用藥在有效抑制白假絲酵母菌的同時放任了其他假絲酵母菌的生長[7]。本研究顯示，RVVC中白假絲酵母菌占90.48%，VVC組白假絲酵母菌占88.68%，均為主要致病菌種。而致病性非白假絲酵母菌以光滑假絲酵母菌多見，其次為熱帶假絲酵母菌，近平滑假絲酵母菌及其他一些假絲酵母菌，與以往文獻(xiàn)報道一致[5-7]。

假絲酵母菌的鑒定有很多方法，如真菌芽管試驗、厚垣孢子形成試驗、快速假絲酵母菌反應(yīng)板(Rapid Yeast ID板)、科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar Candida media)、API 20C AUX和VITEK 2系統(tǒng)等[8-9]。科瑪嘉和安圖顯色培養(yǎng)基均是人工合成底物由產(chǎn)色基因和微生物代謝物質(zhì)的部分組成，可以直接通過觀察菌落顏色對菌株進(jìn)行初步鑒定，Guzel等[10]認(rèn)為科瑪嘉顯色鑒定法是一種可以從陰道樣本快速、有效鑒定致病假絲酵母菌菌種的方法，Hospenthal等[11]的研究顯示科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對白假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率均為98%以上，對光滑假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率為80%，而安圖培養(yǎng)基在陰道致病假絲酵母菌鑒定中的研究卻未見報道。與假絲酵母菌顯色鑒定方法不同，VITEK 2酵母鑒定卡以菌種的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，采用系統(tǒng)自動檢測確定菌株種類，避免了結(jié)果判讀時人為因素造成的影響,因操作簡便、鑒定特異性、敏感性高,常被用作假絲酵母菌菌種鑒定的最終方法[12-13]。本研究正是以VITEK 2為最終鑒定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果提示，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基總體菌株鑒別準(zhǔn)確率為95.1%；對白假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率為98.6%，與既往報道接近[14]；對光滑假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率為92.3%，克柔假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率僅28.7%，與文獻(xiàn)報道存在一定差異[15]。進(jìn)一步分析科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌種鑒定的特異性和敏感性可以看出，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對白假絲酵母菌鑒定的敏感性和特異性均在98.00%以上，光滑假絲酵母菌鑒定的特異性為81.81%，敏感性為72.73%，屬于可接受范圍。

安圖顯色培養(yǎng)基的鑒定結(jié)果與科瑪嘉顯色培養(yǎng)基類似，243株VVC致病菌株的鑒定準(zhǔn)確率為94.70%，白假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率為99.50%，光滑假絲酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率84.60%(略低于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基但未檢出顯著差異)。雖然光滑假絲酵母菌鑒定特異性略高(90.91%)，熱帶假絲酵母菌鑒定特異性和敏感性略低，但兩種培養(yǎng)基在4種主要菌種的特異性和敏感性方面沒有顯著差異。與VITEK鑒定系統(tǒng)相比，兩種顯色培養(yǎng)基均具有操作簡便、價格相對較低、耗時相對較短的優(yōu)點，對白假絲酵母菌鑒定準(zhǔn)確率高，適于當(dāng)前臨床工作中VVC致病菌種的快速鑒別，由于安圖顯色培養(yǎng)基為國產(chǎn)試劑，更具價格優(yōu)勢，因此更具臨床推廣價值。但對于非白假絲酵母菌所致VVC患者，特別是RVVC患者，仍建議進(jìn)行VITEK鑒定以更好地對臨床用藥提供指導(dǎo)。

本研究中安圖顯色培養(yǎng)基、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對克柔假絲酵母菌鑒定的準(zhǔn)確性、特異性和敏感性均低于30%，因其菌株數(shù)較少，對鑒定結(jié)果產(chǎn)生的影響較小。但這種過低的檢驗率標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)引起重視，分析其原因可能在于：(1)非白假絲酵母菌數(shù)量偏少，無法準(zhǔn)確地體現(xiàn)出上述顯色培養(yǎng)基在非白假絲酵母菌鑒定方面的敏感性和準(zhǔn)確性；(2)由于不同的實驗人員對顯色培養(yǎng)基顏色判讀的理解存在差異，可能導(dǎo)致了顏色相近菌株結(jié)果的判讀失誤，如將科瑪嘉的淡紫色菌株誤讀為粉紅色菌株，從而影響了實驗結(jié)果，提高鑒定人員熟練度可能有助于提高顯色培養(yǎng)基對此類菌種鑒定的特異性、敏感性和準(zhǔn)確率。但上述推論仍需更多研究證實。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.032

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160076)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項目(2012HB029)；云南省醫(yī)學(xué)學(xué)科帶頭人培養(yǎng)項目(D-201225)。作者簡介：祁文瑾(1975-)，副教授，博士，主要從事婦產(chǎn)科感染性疾病研究。

R711.72

B

1671-8348(2016)13-1822-03

2015-10-12

2015-12-16)