叔丁基過氧化氫誘導人正常肝細胞系L02自噬模型的建立及其線粒體應激機制

師騰瑞，李　鴿，海春旭，秦緒軍1，，

叔丁基過氧化氫誘導人正常肝細胞系L02自噬模型的建立及其線粒體應激機制

師騰瑞1，3，李鴿2，3，海春旭1，3，秦緒軍1，2，3，*

（1. 第 四軍醫大學預防醫學院毒理學教研室，陜西西安710032；2. 第 四軍醫大學預防醫學院營養與食品衛生學教研室，陜西西安710032；3. 陜西省自由基生物學與醫學重點實驗室，陜西西安710032）

目的： 建立叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導的人正常肝細胞系L02自噬模型并探討其中的線粒體應激機制。方法：體外培養L02細胞，用不同濃度(100、200、400、800、1 000 μmol/L)t-BHP及線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或p38/MAPK特異性抑制劑SB203580進行處理，采用免疫熒光和Western blot檢測自噬標志蛋白LC3-II和p62蛋白水平，以及p38/MAPK信號通路的激活情況；Mito-SOX Red染色流式法檢測細胞線粒體活性氧(ROS)水平。結果：免疫熒光結果顯示t-BHP劑量≥800 μmol/L時可明顯誘導L02細胞內LC3-II發生聚集。Western blot結果顯示，與對照組比較，800和1 000 μmol/L t-BHP處理可顯著增加LC3-II蛋白水平，并降低p62蛋白水平(P均＜0.05)。同時線粒體ROS水平在≥400 μmol/L t-BHP處理后明顯升高，在1 000 μmol/L t-BHP處理后p38蛋白磷酸化水平顯著增加(P均＜0.05)。給予線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或p38/MAPK特異性抑制劑SB203580預處理后可有效拮抗t-BHP(1 000 μmol/L) 處理引起的LC3-II和p62蛋白水平改變。結論：我們成功建立了t-BHP誘導體外培養人正常肝細胞系L02的自噬模型，證明線粒體ROS介導了此過程的發生，同時p38/MAPK通路在此過程中發揮了重要作用。

叔丁基過氧化氫；自噬；線粒體；活性氧；p38/MAPK

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To understand autophagy induction by tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) in human hepatic cell line L02 and to explore the involvement of mitochondria. METHODS：L02 cells were treated with different concentrations of t-BHP (100，200，400，800，1 000 μmol/L) with or without specific inhibitors (mitochondria targeted antioxidant MitoQ or p38/MAPK inhibitor SB203580). Autophagy markers LC3-II and p62 as well as the p38/MAPK pathway proteins were detected by immunofluorescence and/or Western blot. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) were measured by flow cytometry with Mito-SOX Red kit. RESULTS：The high concentrations of t-BHP (≥800 μmol/L) induced the accumulation of LC3 fluorescence puncta，with LC3-II protein level increased and p62 protein level decreased significantly. These changes accompanied the elevated mitochondrial ROS and the activated p38/MAPK pathway. Pretreatment with mitochondria targeted antioxidant MitoQ or specific p38/MAPK inhibitor SB203580 attenuated these changes which were induced by t-BHP (1 000 μmol/L). CONCLUSIONS：We established the autophagy model induced by t-BHP in human hepatic cell line L02. Mitochondrial ROS and p38/MAPK pathway played critical roles in this process.

自噬(autophagy)是一種高度保守的自我消化過程，將各種細胞器或大分子蛋白進行消化降解成為能夠被重新利用的營養成分，從而達到在清除受損細胞器或大分子的同時最大限度地有效利用自身營養成分的目的[1]。自噬是一種普遍存在的生命現象。正常細胞中自噬維持在一個相對較低的水平，營養缺乏、氧化應激以及代謝應激等多種應激條件下可誘導自噬水平的增加[2]。其中氧化應激是多種應激損傷因素共有的機制之一。氧化應激是指機體或細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生超過抗氧化防御體系所能清除的能力而引起的應激損傷作用[3]。ROS與自噬的相關性已有很多文獻報道[4]，但具體機制仍然知之甚少。雖然在很多自噬研究中觀察到了ROS的變化，也通過抗氧化劑干預證明了ROS在自噬中的作用，而直接采用ROS誘導自噬的模型較少。本研究采用氧化劑叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)建立了體外人正常肝細胞系L02自噬模型，進一步觀察了線粒體氧化應激及ROS相關信號通路p38/MAPK在其中的作用，為ROS與自噬的研究提供新的實驗模型和數據。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑及儀器

人正常肝細胞系L02，由本實驗室保存。MitoQ和t-BHP購自Sigma公司；Mito-SOX R ed購自Life T echnologies公司；RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司；兔抗鼠tubulin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗鼠P-p38、p38、p62和LC3-I/II單克隆抗體購自Cell Signaling公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo Fisher公司；p38/MAPK通路抑制劑SB203580購于Selleck公司；Universal Hood II凝膠成像系統為Bio-Rad公司產品；fluo FV10i激光共聚焦顯微鏡為Olympus公司產品；Infinite M200 PRO全波段酶標儀為Tecan產品。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及處理人正常肝細胞系L02細胞，于MEM完全培養基(含青霉素G 100 U/L，鏈霉素100 mg/L，10%胎牛血清)，37 ℃，CO2體積分數為5%條件下常規培養。以2×105/mL接種于培養板或培養皿上，傳代24 h后，分別以100、200、400、800、1 000 μmol/L t-BHP處理L02細胞6 h后檢測自噬及ROS相關指標。在干預實驗中，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ(1和10 μmol/L)和針對p38/MAPK通路的特異性抑制劑SB203580(10 μmol/L)均在t-BHP處理前30 min加入。

1.2.2細胞免疫熒光染色細胞按1.2.1處理后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100破膜5 min，充分洗滌，5% BSA室溫封閉1 h，滴加LC3-I/II抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，充分洗滌，羊抗兔FITC二抗(1∶100)室溫孵育1 h，充分洗滌，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.3細胞線粒體ROS水平檢測細胞接種于6孔板上，分組處理同1.2.1。以1∶1 000 Mito-SOX Red染色30 min，消化、收集細胞，充分洗滌后用流式細胞儀于510和580 nm波長處檢測熒光強度。

1.2.4蛋白免疫印跡實驗消化、收集處理的細胞，以每1×106個細胞加入100 μL RIPA細胞裂解液，裂解充分后以14 000 g、4 ℃離心20 min，取上清為細胞總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量后，加入等體積2×SDS上樣緩沖液(含0.1 mol/L DTT)，100 ℃煮沸5 min。根據BCA蛋白定量結果計算樣品的上樣量，每孔總蛋白25 μg，選用12% SDS-PAGE凝膠和Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，室溫穩壓150 V電泳60 min。采用半干轉裝置將蛋白轉于PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉搖床2 h，TBST洗膜，加入按要求稀釋的兔抗鼠tubulin、P-p38、p38、p62、LC3-I/II單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，發光、凝膠成像系統拍照，結果采用Quantity One軟件進行量化分析。

1.3統計學分析

應用SPSS 1 3.0軟件，結果用x±s表示，采用ANOVA單因素方差分析和t檢驗進行各組間數據的比較。

2　結果

2.1t-BHP處理對L02細胞自噬水平的影響

免疫熒光結果顯示，在不同濃度t-BHP處理條件下，綠色熒光點代表的自噬小體明顯隨劑量的加大而增多，如圖1所示。隨t-BHP濃度增加，蛋白免疫印跡結果顯示，細胞自噬標志蛋白LC3-II表達水平明也依次升高，與對照組相比，在800和1 000 μmol/L時差異具有統計學意義(P＜0.05)；且細胞內p62蛋白水平降低，與對照組相比，在800和1 000 μmol/L時差異具有統計學意義(P＜0.05)，如圖2所示。這些結果均顯示，一定濃度t-BHP可誘導L02細胞發生自噬。

2.2t-BHP處理對L02細胞線粒體ROS的影響以及線粒體靶向抗氧化劑MitoQ的保護作用

采用線粒體ROS探針Mito-SOX Red染色方法測定L02細胞內線粒體ROS水平，結果顯示，細胞內線粒體ROS水平隨t-BHP濃度的增加而增加，與對照組相比，在t-BHP≥400 μmol/L時差異均有統計學意義(P＜0.05)，如圖3所示。針對升高的線粒體ROS，我們采用經典的線粒體靶向抗氧化劑MitoQ(1和10 μmol/L)進行干預，結果發現，與1 000 μmol/L t-BHP單獨處理組相比，MitoQ處理組自噬標志蛋白LC3-II水平隨著MitoQ劑量增加而降低(P＜0.05)，同時p62蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，如圖4所示。以上結果顯示，t-BHP 可通過誘導細胞線粒體ROS水平升高，誘導自噬發生。

圖1　不同濃度t-BHP處理L02細胞6 h后LC3免疫熒光檢測結果

圖2　不同濃度t-BHP處理L02細胞6 h后LC3-II及p62蛋白免疫印跡檢測結果

2.3p38/MAPK通路在t-BHP誘導自噬中的作用

以1 000 μmol/L t-BHP處理L02細胞6 h后，蛋白免疫印跡結果顯示，與對照組相比P-p38蛋白水平顯著升高(P＜0.05)，如圖5所示。針對p38/MAPK通路，給予特異性抑制劑SB203580(10 μmol/L)預處理30 min后，再給予1 000 μmol/L t-BHP處理6 h，蛋白免疫印跡結果顯示，與t-BHP單獨處理組相比，P-p38蛋白水平明顯減少(P＜0.05)，同時LC3-II蛋白水平也隨之下降(P＜0.05)，p62蛋白明顯升高(P＜0.05)，見圖6。以上結果表明，p38/MAPK通路參與了t-BHP誘導的自噬發生。

圖3　不同濃度t-BHP對L02細胞線粒體ROS水平的影響

圖4　 MitoQ對1 000 μmol/L t-BHP誘導L02細胞自噬標志物變化的影響

圖5　t-BHP對L02細胞p38磷酸化水平的影響

3　討論

研究發現多種應激因素誘導自噬均與誘導ROS的產生密切相關[4]，但多數研究中ROS氧化應激同時復合了多種其他應激損傷機制，單一ROS直接誘導自噬的研究報道并不多。建立ROS直接誘導的自噬模型，將進一步確證ROS誘導自噬的獨立作用，同時也將為ROS誘導自噬的分子機制研究，以及針對ROS及相關靶點調控自噬的抗氧化劑篩選提供了合適的研究平臺和手段。

圖6　抑制劑SB203580對t-BHP誘導細胞自噬及p38磷酸化水平的影響

ROS是一類性質活潑的含氧自由基及衍生物的統稱，代表性的有超氧陰離子()、羥自由基(·OH)、單線態氧)和過氧化氫(H2O2)等，其中H2O2由于半衰

22期較長而常被用于氧化應激的誘導劑。但在實際實驗中，H2O2仍然很容易分解而不容易實現較穩定的氧化應激[5]。t-BHP分子結構中一個-(CH3)，置換了H2O2中的-OH，其穩定性加強，而體內代謝后則可重新置換釋放H2O2，從而實現較長時間的氧化應激，因此，t-BHP在許多研究中被作為高效、緩釋的氧化劑使用[6]。如我們實驗室應用t-BHP建立氧化應激復合高脂高糖誘導大鼠胰島素抵抗模型[7]。但尚未有報道將t-BHP作為自噬誘導劑的研究。本研究預實驗中，分別檢測了1h、3h、6h、12h和24h不同處理時間條件下自噬各指標變化，發現6h處理條件下各指標變化明顯且細胞狀態良好，故在整個研究中均選擇6h作為統一的處理觀察時間。

自噬過程由一系列自噬相關蛋白協作共同完成，這些蛋白質在自噬體形成的不同階段發揮作用。當自噬體形成后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺(phosphatidy lethano lamine，PE)偶聯形成LC3-II并定位于自噬體內膜和外膜，并且LC3-II能始終穩定地保留在自噬體膜上直至與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標記，LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數量[8]。在本研究中隨著t-BHP濃度的增加，LC3-II的免疫熒光聚集明顯增加，蛋白印跡雜交結果也證明了LC3-II的水平增加，這提示適量的t-BHP可以明顯誘導自噬的發生。為了確證自噬的發生，我們進一步檢測另一個重要自噬標志物p62。p62是SQSTM1編碼的泛素結合蛋白，參與自噬蛋白降解過程。p62蛋白本身也是自噬的選擇性底物之一，當自噬發生時，細胞內p62被降解，p62蛋白含量降低[9]。在本研究中p62蛋白水平顯著降低，與升高的LC3-II的水平變化相對應，進一步證明t-BHP誘導了自噬的發生。

線粒體是細胞內的重要細胞器，線粒體氧化呼吸鏈也是正常情況下細胞內源性ROS的最主要來源。大量研究表明，線粒體也是眾多內外損傷因素的作用靶點，誘導線粒體大量產生ROS是其中重要的共有機制[10-11]。而最近有研究表明，外源性的氧化應激也往往是通過多種信號通路刺激線粒體產生ROS而發揮作用，出現一種被稱之為“ROS誘導ROS釋放”的現象[12]，本研究中，我們采用線粒體ROS標記探針Mito-SOX Red檢測線粒體內的ROS水平，結果發現，線粒體ROS水平隨著t-BHP的劑量增加而顯著升高，提示了線粒體ROS可能參與了t-BHP誘導的自噬。為了進一步確證線粒體ROS在此過程中的作用，我們采用線粒體靶向抗氧化劑MitoQ進行干預研究。MitoQ是目前研究最多和應用最廣泛的線粒體靶向抗氧化劑，可以不斷地清除過氧化氫、過氧亞硝酸鹽、超氧化物，保護線粒體對抗脂質過氧化[13]。本研究結果發現，MitoQ可以顯著拮抗t-BHP處理引起的LC3-II水平的增加以及p62蛋白的減少，表明線粒體ROS確實參與了t-BHP誘導的自噬的發生。

調控自噬的信號通路很多，主要包括兩類，即依賴mTOR(雷帕霉素靶點)途徑的自噬，具體又包括PI3K/ AKT/mTOR和信號通路[14-15]，以及非依賴mTOR的信號通路。p38/MAPK通路是受氧化應激調控的重要下游信號通路，已有許多報道認為p38/MAPK通路可以調節依賴mTOR信號通路的自噬[16]。為了明確p38/MAPK通路在t-BHP誘導自噬過程中的作用，首先我們觀察了p38蛋白及其磷酸化激活情況，結果發現t-BHP處理可以顯著提高p38的磷酸化水平，提示p38/MAPK通路可能參與了t-BHP誘導的自噬的發生。為了進一步確證，我們采用p38/MAPK特異性抑制劑SB203580進行干預處理，結果發現，抑制p38/MAPK通路后可以有效拮抗t-BHP處理引起的LC3-II蛋白水平的增加以及p62蛋白水平的減少，表明p38/MAPK通路參與了t-BHP誘導自噬的發生。

綜上所述，本研究成功建立了t-BHP誘導的體外人正常肝細胞系L02的自噬模型，并且初步證明了線粒體ROS介導了該自噬過程的發生，在此過程中p38/MAPK通路發揮了重要作用。該模型將為ROS直接誘導自噬的研究提供了實驗手段，同時也為將來進一步針對線粒體為靶點的抗氧化調控自噬的研究提供了可靠的平臺。

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Involvement of mitochondria for induction of autophagy by tert-butyl hydroperoxide in human hepatic cell line L02

SHI Tengrui1，3，LI Ge2，3，HAI Chunxu1，3，QIN Xujun1，2，3，*
(1. Department of Toxicology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 2. Department of Nutrition and Food Hygiene, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032; 3. The Key Laboratory of Free Radical Biology and Medicine of Shaanxi Province, School of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

tert-butyl hydroperoxide；autophagy；mitochondria；reactive oxygen species；p38/MAPK

R114；R992

A

1004-616X(2016)02-0091-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.002

2015-12-15；

2016-01-19

國家自然科學基金(81270417，31070766，30300074)；陜西省青年科技新星人才基金(2010KJXX-06)

作者信息： 師騰瑞，E-mail：526611412@qq.com。*

，秦緒軍，E-mail：qinxujun@hotmail.com