石油降解菌的分離及降解能力的初步研究

吳金山，李明華,2

(1 鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司，江蘇　射陽　224300； 2 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇　淮安　223003)

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石油降解菌的分離及降解能力的初步研究

吳金山1，李明華1,2

(1 鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司，江蘇射陽224300； 2 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安223003)

以柴油為唯一碳源，從石油污染嚴重的土壤中篩選到8株石油降解菌，其中菌株SH-5降解能力最強，培養5天后柴油降解率高達35.8%，經初步鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬。研究表明，環境條件顯著影響SH-5菌株的柴油降解效率，在培養溫度為35℃，pH為7.5，培養時間為5 d，柴油濃度較低時，石油降解率較高。

土壤；石油污染；生物降解；篩選

石油是一種由各種烷烴、環烷烴、芳香烴等化合物組成的粘稠、深褐色液體，是交通運輸、工業生產的重要能源及原料[1]。在石油開采、運輸和冶煉過程中，因泄露造成的土壤污染事件時有發生，嚴重影響了正常的農業生產及人們的身心健康。因此，開展土壤石油污染治理工作已成為環境保護的重要內容之一。

相對于物理、化學處理法，生物修復法治理石油污染具有安全高效、操作簡單、成本低廉等優點，具有廣闊的發展前景和重要的社會價值[2-3]。本文旨在篩選能夠降解石油的微生物，并進一步考察菌株對石油的降解能力，以期應用于石油污染土壤的治理之中。

1　材料與方法

1.1土壤樣品

實驗所用土壤樣品采自蘇北某油田長期污染的距地表15 cm土壤，除掉沙粒等雜物后置于無菌容器中，然后放入4℃冰箱中備用。

1.2培養基

石油培養基：NH4NO32.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO43.0 g，MgSO40.4 g，FeSO40.02 g，CaCl20.01 g，蒸餾水1000 mL，0#柴油5.0 g，pH 7.0～7.2。加入1.5%～2%的瓊脂粉即為石油固體培養基。

LB培養基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.5。在其中加入1.5～2%瓊脂即為LB固體培養基。

1.3石油降解菌的富集

取5.0 g土壤樣品加入含有50 mL石油培養基的250 mL三角瓶中，置于30℃搖床中以150 rpm的轉速培養5 d，然后靜置10 min后，取上層懸液5 mL加入50 mL新鮮的石油富集培養基中，在相同條件下繼續培養5 d，如此重復4次。

1.4石油降解菌的分離

將富集培養液梯度稀釋后，取0.2 mL涂布至石油固體培養基上，置于30℃恒溫培養箱中培養5～7 d，直至長出較大的單菌落。挑取長勢良好的不同形態的菌落，反復劃線分離，直至鏡檢無雜菌。將分離到的各菌株劃線至LB固體培養基上培養后，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，30℃、150 rmp條件下培養24 h后作為液體種子，按10%的比例接種于石油液體培養基中，同條件下培養5 d后，測定石油降解率。

1.5石油降解率測定方法

采用紫外分光光度計法在225 nm波長下測定培養液中殘油的含量[4]，每個樣品重復測定3次。石油降解率按下式計算：

式中：m0——起始含油量，g/L

m1——降解后的含油量，g/L

1.6菌株初步鑒定方法

應用傳統的方法，根據所得菌株的形態特征及生理生化試驗反應[5]，參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)對菌株進行初步鑒定[6]。

1.7菌株石油降解特性

1.7.1不同培養溫度對柴油降解率的影響

將分離到的石油降解菌接入石油培養基中，在轉速為150 rpm 的恒溫搖床中，分別以20、25、30、35和40℃的溫度培養5 d后，測定柴油的降解率。

1.7.2不同pH對柴油降解率的影響

將分離到的石油降解菌接入初始pH分別為5.5～8.5的石油培養基中，在30℃、150 rpm的恒溫搖床中振蕩培養5 d后，分別測定在不同pH條件下柴油的降解率。

1.7.3不同培養時間對柴油降解率的影響

將菌株接入石油培養基中，在30℃、150 rpm的搖床中培養，在培養1、3、5、7、9、11 d時取樣，測定柴油的降解率。

1.7.4不同柴油濃度對柴油降解率的影響

分別配制柴油含量分別為 1、3、5、7、9、11 g/L的石油培養基，接入石油降解菌，在30℃、150 rpm的恒溫搖床中振蕩培養5 d后，測定柴油的降解率。

2　結果與分析

2.1石油降解菌的篩選和菌株鑒定

經過富集培養和分離純化后，從被長期污染的土壤中獲得了能夠在柴油為唯一碳源的培養基中生長良好的菌株，分別命名為SH-1～SH-8。將獲得的菌株接入石油培養基培養5 d后，測定柴油降解率，結果如表1。

表1　柴油降解菌株的柴油降解率

由表1可以看出，經過5d的培養，篩選到的菌株對柴油均具有降解能力，菌株SH-2、SH-5和SH-6對柴油的降解率均達20%以上，其中菌株SH-5的降解能力最強，達35.8%。根據菌株SH-5的形態學特征和生理生化反應，可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

2.2菌株SH-5的柴油降解特性

2.2.1培養溫度對柴油降解率的影響

由圖1可得，溫度對石油降解率影響較大。隨著培養溫度的升高，菌株的生長速度加快，相關酶含量增多，柴油降解率即升高，在35℃時達到最大，降解率為36.28%，但當培養溫度超過35℃時，因不利于菌株的生長或影響到酶活性，導致柴油降解率逐漸下降。

圖1　培養溫度對柴油降解率的影響

2.2.2初始pH對柴油降解率的影響

由圖2可以看出，在初始pH為7.5時，SH-5菌株對柴油的降解率最高，為35.17%。培養基pH過高或過低時，會影響到菌株的正常生長并降低相關酶的活性，從而降低柴油的降解率。

圖2　初始pH對柴油降解率的影響

2.2.3培養時間對柴油降解率的影響

在石油培養基中，營養成分含量較低，菌株生長較慢，培養3 d時，柴油降解率僅為15.65%(圖3)。隨著培養時間的延長，柴油降解率逐漸升高，在培養5 d時，基本達到最高，達36.28%。此后，因培養基中營養成分逐漸耗盡，菌株活力降低，繼續延長培養時間并未能顯著提高柴油降解率。

2.2.4柴油濃度對柴油降解率的影響

由圖4可以看出，柴油降解率隨其濃度的提高而降低。柴油濃度越低，降解率越高；反之則越低，在柴油含量為為11 g/L 時，降解率僅為8.72%。柴油含量超過9 g/L時，可能已明顯影響到菌株的生長，甚至導致其死亡，從而降低對柴油的降解率。

圖4　柴油濃度對柴油降解率的影響

3　結　論

經過富集和篩選，從石油污染土壤中獲得了8株具有石油降解能力的微生物，其中菌株SH-5石油降解能力最強，在柴油含量為5 g/L的培養基中培養5 d后，石油降解率達35.8%，經過形態觀察及生理生化實驗表明，該菌株為芽孢桿菌屬。

對菌株SH-5柴油降解性能的研究表明，培養條件對柴油的降解率有明顯影響。在溫度35℃，pH 7.5、培養時間為5 d，柴油濃度低于5 g/L時，SH-5菌株的柴油降解率較高，柴油濃度高于9 g/L，降解率較低。

[1]《原油、輕烴、液化石油氣質量檢驗》編寫組．原油,輕烴,液化石油氣質量檢驗[M]．北京:石油工業出版社,2001:1-24．

[2]王洪君,吳任鋼,王嘉麟.生物技術處理冀東油田含油土壤[J]．環境科學研究，2000,13(5):20-23.

[3]黃敏剛,付瑞敏,谷亞楠,等.高效石油降解菌的篩選及在石油污水處理中的應用[J].湖北農業科學,2015,54(13):3104-3017.

[4]SY/T 0530-93 油田污水中含油量測定方法—分光光度法[S].

[5]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:242-398.

[6]R E 布坎南,NE 吉本斯,等.伯杰細菌鑒定手冊.8版[M],北京:科學出版社,1984:729-795.

Isolation of Petroleum Degradation Bacteria and Their Biodegradation Characteristics

WU Jin-shan1,LI Ming-hua1,2

(1 Yancheng JK Sucralose Inc,Jiangsu Sheyang 224300; 2 Jiangsu Food &Pharmaceutical Science College,Jiangsu Huai’an 223003,China)

Eight petroleum-degrading bacteria strains were isolated from oil-contaminated soil with diesel oil as a sole carbon source.Among these strains,SH-5 identified as Bacillus sp.had the highest oil-degradation rate of 35.8% after culturing in a diesel oil-containing medium for 5 days.The optimal conditions for oil degradation were the temperature of 35℃,pH of 7.5,time of 5 d and in the medium containing low concentration of oil.

soil;petroleum pollution;biological degradation;isolation

吳金山(1967-)，男，碩士，高級工程師，主要從事化工方面的研究。

X172

A

1001-9677(2016)04-0074-03