沉香形成對白木香果皮化學組成的影響研究*

董　雷，馮美柔，陳曉穎，郭曉玲，章衛民，高曉霞

(1 廣東藥學院藥科學院，廣東　廣州　510006；2 廣東省微生物研究所， 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室， 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東　廣州　510070； 3 北京匯誠瑞祥醫藥技術有限公司，北京　101111)

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沉香形成對白木香果皮化學組成的影響研究*

董雷1,3，馮美柔1，陳曉穎1，郭曉玲1，章衛民2，高曉霞1

(1 廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；2 廣東省微生物研究所， 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室， 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東廣州510070； 3 北京匯誠瑞祥醫藥技術有限公司，北京101111)

分析了沉香樹脂形成對白木香果皮揮發性成分的影響。以19批結香和未結香白木香的果皮為材料，GC-MS聯用技術構建白木香果皮揮發性成分指紋圖譜并用《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》進行相似度評價。正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)將樣品進行分組，變量權重(VIP)法篩選出組間差異性化合物。自動質譜退卷積定性系統(AMDIS)結合保留指數(RI)鑒定差異組分。結果表明：已結香、未結香白木香果皮指紋圖譜相似度均差異較大，其相似度范圍為0.376～0.882。白木香果皮按照人工誘導時長、人工誘導方式的不同分為兩組。AMDIS結合RI共鑒定出11個差異組分，差異組分色譜峰峰面積之和占總峰面積的44.08%～72.43%。沉香(樹脂)形成對白木香果皮揮發性成分可產生一定影響，但未結香、已結香果皮揮發性成分的組成未呈顯著性差異。

白木香果皮；沉香形成；正交偏最小二乘判別分析

白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)又名土沉香，熱帶及亞熱帶常綠喬木，屬瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)，是我國特有的沉香屬植物和瀕危珍稀藥用植物，分布于廣東、廣西、海南、臺灣及云南等地。白木香在自然條件下正常生長，在受到外界刺激時會發生防御性反應從而產生樹脂(沉香樹脂)，包被心材，進而形成沉香[1]。沉香作為傳統名貴中藥，是廣東道地藥材“十大廣藥”之一，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥[1]。此外，沉香還是我國、日本、印度以及其他東南亞國家的傳統名貴天然香料，它被作為佛教的供養香料，被提取成沉香精油或被制成珍貴的工藝品。

因沉香的采收需“伐樹取香”，全球野生沉香資源瀕臨滅絕。以人工誘導的方式促使沉香樹植物產生樹脂，是目前沉香研究的熱點之一。如魏建和等開發的“通體結香技術”[2-3]，高曉霞等提出的“小孔滴注法”人工造香技術[4-7]，分別在結香6和12個月生產的人工沉香藥材即可滿足《中國藥典》[1]的要求。由于白木香采香后其余樹干、莖、葉、果實等材料均被廢棄，造成資源的浪費，因此人們開始關注白木香葉、果實等天然資源的開發和利用。本課題組在前期研究中發現白木香果皮提取物具有抗菌[8]、抗腫瘤[9]、清除DPPH自由基和抑制酪氨酸酶活性[10]的作用，并從白木香果皮中分離到木香烴內酯、木犀草素、葫蘆素E等抗腫瘤、抗菌活性成分[11-12]。為進一步明確人工誘導過程中，沉香樹脂的形成對白木香果皮化學組成的影響，本文應用GC-MS聯用技術分析結香、未結香白木香果皮，建立白木香果皮GC-MS指紋圖譜，結合多元統計分析方法辨識白木香果皮揮發性成分差異，以期為白木香果皮的綜合開發利用提供基礎數據。

1　材料與儀器

白木香果實由廣東省信宜市珍稀沉香發展有限公司提供，經廣東藥學院中藥學院嚴寒靜副教授鑒定為白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg 的果實。果實置于室內陰干，將種子從果實中去除后即為果皮。19批白木香果皮，1～5號樣品為未結香白木香果皮，6～19號樣品為已結香白木香果皮。未結香的白木香主要判斷的依據為：白木香種植于信宜市金垌鎮苗圃基地，未進行人工造香試驗，且未觀察到斷枝、倒伏、雷擊、腐木、蟲蟻蛀的孔洞等可能形成沉香樹脂的情況。6～19號樣品為不同方式進行人工誘導的白木香，其中6～8號為混合化學試劑誘導，9～12號為化學試劑結合Botryosphaeria rhodina A13，13號為Glomerella cingulata A12誘導，14號為甲酸結合Hypocrea jecorina M71，15號為甲酸結合Fusarium sp.A2誘導，16～19號為僅甲酸誘導。

人工誘導所用菌株：葡萄座腔菌(B.rhodina A13，EU78167)、圍小叢殼菌(G.cingulata A12，EU781669)、紅褐肉座菌(H.jecorina M71)、和鐮刀菌(F.sp.A2，EU781659)[13]由廣東省微生物研究所章衛民研究員提供和鑒定。人工誘導方法詳見參考文獻[4-6]。

HP5890GC/HP5972MS氣相色譜-質譜聯用儀，美國HP公司；Varian Cpsil 5 CB彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司，HH-6數顯電子恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠。

C8～C40正構烷烴(編號DRH-008SR2)，美國AccuStandard公司(溶于三氯甲烷中，500 μg/mL)，三氯甲烷(AR)，廣州化學試劑廠。

表1　白木香果皮樣品來源

2　方　法

2.1供試品溶液的制備

白木香果實，陰干，果皮粉碎(過60目篩)。取果皮粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL，密塞搖勻，冷浸24 h，搖勻，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加三氯甲烷使溶解，轉移至1 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾(0.45 μm)，取續濾液，即得。

2.2色譜及質譜條件

色譜柱為Varian CPsil 5CB毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為260℃；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL·min-1；分流比為3:1；進樣量：1 μL；升溫程序：90℃保持4 min，以2.5℃·min-1升溫至160℃，保持5 min，再以0.3℃·min-1升溫至180℃，保持5 min，然后以2℃·min-1升溫至200℃，最后以1℃·min-1升溫至230℃，保持120 min。

離子源為EI；電離能量70 eV；電離電壓1977 mV，離子溫度171℃，溶劑延時5 min；質量掃描范圍50～550 m/z。

2.3精密度試驗

取白木香果皮粉末(11號)1份，按“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜及質譜條件進行GC-MS分析，連續進樣6次，采用《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》進行評價，相似度均大于0.995，表明儀器精密度良好。

2.4重復性試驗

分別取白木香果皮粉末(11號)6份，按“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜及質譜條件進行GC-MS分析，采用《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》進行評價，相似度均大于0.990，表明方法重復性良好。

2.5穩定性試驗

取同一供試品溶液(11號)，分別在0 h，5 h，10 h，15 h，20 h進樣，采用《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》進行評價，相似度均大于0.994，表明供試品溶液在20 h內穩定。

2.6樣品測定

取“2.1”項下制備的供試品溶液各1 μL，19批白木香果皮樣品每批取3份按照“2.2”項下所述條件進行測定，取相似度均在0.99以上的3個譜圖中的一個代表該樣本的圖譜，即19批沉香樣本以19張指紋圖譜進行分析。

2.7數據處理

樣品的總離子流圖導入《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》進行數據處理，計算指紋圖譜的相似度。正構烷烴和供試品在相同色譜-質譜條件下進樣，記錄各正構烷烴的保留時間，使用島津GC-MS solution工作站的自動調整保留時間(Automatic Adjustment of Retention Time，AART)功能，計算數據文件中各成分的保留指數(Retention Indices，RI)。自動質譜退卷積定性系統(Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System，AMDIS)處理樣品的總離子流圖，去除噪音和圖譜重疊的干擾[14]，結合NIST05數據庫標準質譜信息比對和保留指數校正[15]進行色譜峰的鑒定。

采用XCMS數據包在R-gui(3.1.0)環境下對GC-MS樣品數據文件進行反褶積和對齊，得到包含質量離子峰面積的XCMS三維數據矩陣[6]，以全譜碎片信息為變量導入SIMCA-P 12.0軟件中進行有監督模式識別正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)。

3　結　果

3.1指紋圖譜的建立及相似度評價

19批白木香果皮樣品的GC-MS數據導入國家藥典委員會推薦的《中藥指紋圖譜相似度評價(2004 A版)》系統，選取“時間窗”寬度為0.5 min，平均數法，經多點校正后自動匹配，得到19批樣品的指紋圖譜和對照指紋圖譜(圖1)。白木香果皮指紋圖譜與對照指紋圖譜比對，相似度結果見表2。結果表明，結香、未結香白木香果皮指紋圖譜相似度均差異較大，其相似度范圍為0.376～0.882。

圖1　19批白木香果皮GC-MS指紋圖譜

樣品編號相似度S10.793S20.454S30.482S40.499S50.387S60.545S70.376S80.743S90.737S100.527S110.545S120.717S130.589S140.882S150.875S160.778S170.748S180.786S190.777S110.545S120.717S130.589S140.882S150.875

續表2

S160.778S170.748S180.786S190.777

3.2模式識別分析及差異組分的鑒定

圖2　19批白木香果皮全譜碎片信息的OPLS-DA結果

正交偏最小二乘法(OPLS)是一種新型的多元統計數據分析方法，為多因變量對多自變量的回歸建模方法，其最大的特點是去除自變量中與分類變量無關的數據變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，可以解決由色譜和質譜產生的高維數據降維、分類可視化和特征篩選等問題[16]。為進一步分析結香對白木香果皮化學組成的影響，本文在R-gui環境下采用XCMS數據包提取19批白木香果皮的三維數據矩陣，其中包括樣本名稱、碎片信息(保留時間-質荷比)和離子強度。將數據矩陣進行歸一化處理后導入SIMCA-P軟件中進行OPLS-DA判別分析，結果見圖2。白木香果皮很明顯分布在t1軸的左右兩側，右側Group2為9、14～19號7批果皮樣品，其余12批樣品聚集在t1軸左側為Group1。在建立的模型中，PC1和PC2在變量X上的總貢獻率為96%(R2X=0.96)，在變量Y上的總貢獻率為71.7%(R2Y=0.717)，同時根據交叉驗證預測能力為55.7%(Q2(cum)=0.557)。Group1中7批樣品分別為甲酸與Botryosphaeria rhodina A13、甲酸與Hypocrea jecorina M71、甲酸與Fusarium sp.A2綜合法誘導結香18個月的樣品，以及僅甲酸誘導結香12個月的樣品。Group2為未結香的白木香果皮以及人工誘導12個月的樣品。

在有監督模式識別的OPLS-DA模型中，最常用來評價變量貢獻的方法是變量權重(Variable important in the projection，VIP)法。應用變量權重法篩選組間差異性化合物，VIP>1.0的變量具有統計學意義[17]。本文以VIP>1.0(圖 3)作為標準篩選對模型上兩組間分離有貢獻的變量，共篩選出11個差異組分。采用AMDIS處理各樣品總離子流圖，消除噪聲和圖譜疊合的干擾，提取每一差異組分的質譜信息與NIST05質譜庫中的標準質譜圖進行比對，結合保留指數校正鑒定差異組分，并以質譜圖匹配度高、保留指數最接近的化合物為最佳鑒定結果。結合保留指數(RI)共鑒定出11個差異組分(表3)，包括脂肪烷3個、脂肪酸酯2個、甾醇類2個、三萜類2個、苯并二氫吡喃醇衍生物2個，差異組分色譜峰峰面積之和占總峰面積的44.08%～72.43%。

圖3　19批白木香果皮揮發性成分OPLS-DA模型VIP柱狀圖

峰號tR/min化合物名稱分子式RIaRIbVIP值172.85n-Hexadecanoicacidn-棕櫚酸C16H32O2198019843.027275.47Hexadecanoicacid,ethylester十六烷酸乙酯C18H36O2200020031.5253161.35Nonacosane二十九烷C29H60290429906.1224176.33β-Tocopherolβ-生育酚C28H48O2303632732.0885183.55Hentriacontane三十一烷C31H64310334119.5686184.27VitaminE維生素EC29H50O2314934301.5217195.42Stigmasterol豆甾醇C29H48O323436332.4948203.62β-Sitosterolβ-谷甾醇C29H50O324337932.9529208.95Lupeol羽扇豆醇C30H50O332538911.55710211.18Hentriacontane三十六烷C36H74360039335.43511212.32Lup-20(29)-en-3-ol,acetate,(3á)-乙酸羽扇豆醇酯C32H52O2337239551.426

注：a為NIST庫中檢索的化合物RI值，b為計算的RI值。

4　討　論

沉香(樹脂)形成對白木香果皮揮發性成分可產生一定影響，但未結香、已結香果皮揮發性成分的組成未呈顯著性差異。指紋圖譜相似度評價和正交偏最小二乘判別分析的結果均表明：不同人工誘導方式、誘導方式相同而時長不同的白木香果皮可以分為2組。未結香白木香果皮與混合化學試劑、化學試劑結合真菌的綜合法人工誘導12個月果皮分為一組。甲酸人工誘導12個月、甲酸結合真菌人工誘導18個月的果皮分為一組，提示甲酸人工誘導方式對白木香果皮化學組成影響較大。

白木香果皮化學組成較豐富，并表現出多種生物活性。本研究結果進一步顯示白木香果皮化學組成在一定程度上受白木香結香與否的影響，為今后進一步合理開發利用白木香果皮資源提供了基礎數據。

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Analysis of the Effect of Agarwood Formation on the Volatile Components in Pericarps of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg*

DONG Lei1,3,FENG Mei-rou1,CHEN Xiao-ying1,GUO Xiao-ling1,ZHANG Wei-min2,GAO Xiao-xia1

(1 Department of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical College,Guangdong Guangzhou 510006; 2 State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Guangzhou 510070; 3 Beijing Novelpharm Consulting Co.,Ltd.,Beijing 101111,China)

To analyze the effect of agarwood formation on volatile components in the pericarps of Aquilaria sinensis,nineteen batches samples were analyzed by gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS),and similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine (2004A version) was used.Orthogonal partial least squares discriminate analysis (OPLS-DA) and variable important in the projection (VIP) were employed to identify different components of the pericarps A.sinensis.The different components were identified by automated mass spectral deconvolution and identification system (AMDIS) combined with retention index (RI).Results showed the correlation coefficient of the 19 batches of the pericarps A.sinensis ranged from 0.376～0.882.OPLS-DA scores plots of spectrum fragmentation information showed that samples were divided into 2 groups according to agarwood inducement method and resins formation time.11 different components were identified and quantified,which accounted for 44.08%～72.43% of the total content.The results suggested that the different components in the pericarps of A.sinensis were related to the formation of agarwood.But there were not significant differences between the pericarps of non-resinous and agarwood-producing Aquilaria tree.

the pericarps of Aquilaria sinensis;agarwood formation;OPLS-DA

廣東省基礎與應用基礎研究專項資金(2014A030313583)；廣東藥學院藥科學院青年教師科研培育基金(2014No.5)。

董雷(1978-)，男，碩士研究生，研究方向：藥物分析。

高曉霞(1972-)，女，教授，博士，研究方向：中藥制劑質量控制。

Q946

A

1001-9677(2016)04-0046-05