LCMSMS法測(cè)動(dòng)物源食品中硝呋烯腙殘留量的不確定度評(píng)定

羅艷霞

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海　200233)

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LCMSMS法測(cè)動(dòng)物源食品中硝呋烯腙殘留量的不確定度評(píng)定

羅艷霞

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200233)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源食品硝呋烯腙的方法，并對(duì)其不確定度進(jìn)行了評(píng)定。本文研究了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源食品硝呋烯腙含量的方法，并依據(jù)CNAS-GL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》規(guī)定的原理與方法，分析了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不確定性的來(lái)源，建立了不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型，計(jì)算并分析了合成不確定度的結(jié)果。由結(jié)果可知：在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源食品硝呋烯腙含量過(guò)程中，校準(zhǔn)曲線擬合與標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置是影響其不確定度的主要因素，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和測(cè)量重復(fù)性是次要因素。

LCMSMS；動(dòng)物源性食品；硝呋烯腙；不確定度

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó)，隨著人們對(duì)動(dòng)物源食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，動(dòng)物源食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)[1]。目前在養(yǎng)殖過(guò)程中，普遍濫用藥物添加劑或高效抗生素等成為影響動(dòng)物源性食品安全的主要原因。隨著人們對(duì)食品與環(huán)境質(zhì)量要求的不斷提高及對(duì)抗生素認(rèn)識(shí)的不斷深入，飼料中抗生素的添加所引起的問(wèn)題愈來(lái)愈引起人們的關(guān)注。

硝呋烯腙 (Nitrovin)是20世紀(jì)70年代中期發(fā)現(xiàn)的一種新型抗生素，它是一種呋喃類化學(xué)合成藥物,它通過(guò)增加動(dòng)物腸粘膜的通透性，從而能有效地提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物消化道中的消化和吸收；還能夠有效抑制動(dòng)物消化道內(nèi)病原微生物對(duì)葡萄糖的利用，使其新陳代謝過(guò)程受阻，從而抑制和殺滅多種病原微生物，減少動(dòng)物感染疾病的機(jī)會(huì)，提高抗病能力[2]。由于抗生素的耐藥性、殘留和二重感染的特性，所帶來(lái)的弊端和危害已成為人類所面臨的重大挑戰(zhàn)。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告(第193號(hào))：食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單明確指出硝呋烯腙禁止使用。因此，研究建立動(dòng)物源性食品中硝呋烯腙的殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

目前有關(guān)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的硝呋烯腙殘留量的方法有高效液相色譜法[3]，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]等少量的文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)家也尚未制定相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本文建立了硝呋烯腙的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，其中硝呋烯腙色譜峰保留時(shí)間是3.47min, 線性范圍是1.0～50ng/mL，相關(guān)系數(shù)R為0.999。該方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，有利于食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的批量檢驗(yàn)。并且依據(jù)CNAS-GL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[6]和JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[7]規(guī)定的原理與方法，對(duì)本文測(cè)試方法的準(zhǔn)確可靠性進(jìn)行了詳細(xì)的分析，用合成不確定度[8-13]為測(cè)量結(jié)果提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料

1.1.1試劑

硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer； 乙腈(色譜純)，F(xiàn)isher；甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher；甲酸(分析純)，國(guó)藥；二甲基甲酰胺(分析純)，國(guó)藥。

1.1.2儀器

AB4500型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)儀，ABSCIEX公司；FE20K型酸度計(jì)、MS204S型電子天平、XS105型電子天平，瑞士梅特勒托利多；SF-DL-4M型高速冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器公司；SK250H型超聲振蕩儀，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取10.00mg硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，加入2mL二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇定容，混勻，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用單標(biāo)線刻度為1mL的移液管準(zhǔn)確移取0.1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至100mL容量瓶中，甲醇釋至刻度，混勻，此標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度為 100ng/mL；再用10mL刻度移液管分別移取0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液于5只10mL容量瓶中，甲醇釋至刻度，混勻，配置成的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為1.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL(注：此處移液管、容量瓶均為A級(jí))。

1.2.2樣品預(yù)處理

精密稱取5.0000g樣品于50mL離心管中，用A級(jí)10mL刻度移液管吸取6mL二甲基甲酰胺加入離心管，振搖分散樣品，再加入9mL乙腈，超聲提取20min，4000r/min冷凍離心10min，過(guò)0.45和0.22μm有機(jī)膜，供LC-MS-MS分析測(cè)定。

1.2.3儀器條件

1.2.3.1液相色譜條件

表1　流動(dòng)相梯度條件Table 1　Mobile phase gradient conditions

色譜條件：色譜柱為AgilentC18(4.6x250mm, 5μm)；進(jìn)樣量10μL；流速為0.3mL/min；柱溫為 30 ℃；流動(dòng)相A相甲醇，B相0.1%甲酸水溶液(見(jiàn)表1)。

1.2.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI+)離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電壓：5500V；霧化氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：35psi；輔助氣壓力：50psi；碰撞氣壓力：9psi；離子源溫度：500 ℃；碰撞室入口電壓：10V；碰撞室出口電壓：6V；硝呋烯腙最佳碰撞電壓、碰撞能量等如表2所示。

表2　硝呋烯腙的離子對(duì)Table 2　The ion pair of nitrovin

1.3數(shù)學(xué)模型的建立[8-9]

樣品中硝呋烯腙含量計(jì)算公式如下：

式中: X——樣品中硝呋烯腙含量，μg/kg

C——樣品溶液中硝呋烯腙濃度,ng/mL

V——樣品定容體積，mL

m——樣品質(zhì)量，g

上述計(jì)算公式是由測(cè)量原理得到的，沒(méi)有考慮各種隨機(jī)因素對(duì)不確定度的影響，在此引入反映隨機(jī)影響的重復(fù)性系數(shù) frep，其數(shù)值等于1。評(píng)定不確定度的數(shù)學(xué)模型應(yīng)寫成如下形式：

1.4測(cè)量不確定度因素[8-13]

依據(jù)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型，不確定度的主要因素有：實(shí)驗(yàn)重復(fù)性條件產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(frep);樣品稱樣量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(m);樣品定容體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(V);標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C);校準(zhǔn)曲線擬合引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(Co); 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀定量重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定uref(LCMSMS)。合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(X)計(jì)箅公式如下：

2　結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)重復(fù)條件下產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(frep)

對(duì)樣品進(jìn)行7次重復(fù)測(cè)定所得到數(shù)據(jù)如表3所示。

表3　樣品測(cè)定結(jié)果Table 3　Samples determination results

重復(fù)測(cè)量7次的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

日常測(cè)量時(shí)為平行測(cè)定，結(jié)果是平均值，故平均值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

實(shí)驗(yàn)重復(fù)條件下產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差，考慮了所有的隨機(jī)影響。因此在分析之后的各因素時(shí)，無(wú)需考慮隨機(jī)影響。

2.2樣品稱樣量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(m)

用天平稱取5.0000g樣品時(shí)，因天平所允許的最大誤差為±0.0001g, 按矩形分布分析，稱樣時(shí)天平引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3樣品定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(V)

2.4硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度uref(C)

2.4.1配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C1)

(1)由硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)品證書可知其純度為98.5%，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度為：

(2) 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品硝呋烯腙時(shí)，天平所允許的最大誤差為±0.01mg, 按矩形分布分析，天平引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4)因此配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液時(shí)所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C1)為：

2.4.2配制標(biāo)準(zhǔn)中間液所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C2)

2.4.3配制標(biāo)準(zhǔn)工作液所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C3)

依據(jù)JJG196-2006[14]常用玻璃量器檢定規(guī)程,據(jù)三角形分布分析,配制標(biāo)準(zhǔn)工作液所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C3)見(jiàn)表4[9]。

表4　標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 4　The introduction of relative standard uncertainty of standard working liquid

①按三角分布分析，研討溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度0.00048，可知uref(VAi)為：

②按三角分布分析，研討溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度0.00048，可知uref(VBi)為：

③綜合以上得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C3)：

2.4.4配制硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C)

2.5校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(Co)

用LCMSMS測(cè)定硝呋烯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液5個(gè)濃度水平，可知相應(yīng)的峰面積，運(yùn)用最小二乘法擬合，擬合方程Y=aC+b和相關(guān)系數(shù)r(見(jiàn)表5)。

表5　測(cè)定及由擬合方程計(jì)算結(jié)果Table 5　Measurement and calculation results by fitting equations

注：a=35242,b=2406,r=0.999。

依據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品測(cè)定10次，得到的樣品溶液濃度測(cè)定結(jié)果表6所示。

表6　樣品溶液濃度測(cè)定結(jié)果Table 6　Sample solution concentration determination results

計(jì)算可知：C0=7.826ng/mL，X=23.48μg/kg

由標(biāo)準(zhǔn)曲線求濃度時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(C0)由下式計(jì)算[9]：

式中：a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率

P——重復(fù)測(cè)定樣品的數(shù)量

m——重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的數(shù)量

n——配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)量

Sy/c——工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差

Sc/c——工作曲線各濃度點(diǎn)的離均差平方和

Yij——工作曲線各濃度點(diǎn)的測(cè)定響應(yīng)值

Yi——由線性方程計(jì)算所得響應(yīng)值

Ci——工作曲線各濃度點(diǎn)

C0——測(cè)試樣平均濃度

由以上公式計(jì)算的結(jié)果見(jiàn)表7。

表7　最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入的不確定度uref(C0)Table 7　Least squares fitting in uncertainty of standard curve

2.6液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在測(cè)量過(guò)程中所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(LCMSMS)

2.7合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度及評(píng)定擴(kuò)展不確定度

2.7.1合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

依據(jù)文中各項(xiàng)不確定度分量(見(jiàn)表8)，合成得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(X):

=0.0548

表8　各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總表Table 8　Each relative standard uncertainty componentssummary table

2.7.2擴(kuò)展不確定度

當(dāng)包含因子k=2,置信水平約為95%,依據(jù)公式計(jì)算可得相對(duì)擴(kuò)展不確定度uref(X):

Uref(X)=uref(X)×k=0.1096

依據(jù)表6計(jì)算得，動(dòng)物源性樣品中硝呋烯腙測(cè)定的殘留量的最佳預(yù)估值為23.48μg/kg，故其擴(kuò)展不確定度U為：

U=23.48×Uref(X)=2.6μg/kg

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性樣品中硝呋烯腙殘留量，當(dāng)k=2，置信水平是95%時(shí)，測(cè)得的硝呋烯腙含量為(23.48±2.6)μg/kg。本文中實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，用來(lái)對(duì)動(dòng)物源性食品中硝呋烯腙的測(cè)定準(zhǔn)確可靠性較高。

對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及不確定度分量結(jié)果綜合分析可知：在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物源食品硝呋烯腙殘留量過(guò)程中，校準(zhǔn)曲線擬合與標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置是影響其不確定度的主要因素，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和測(cè)量重復(fù)性是次要因素。

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Nitrovin Residues inAnimal-originFoodbyLiquidChromatographyTandemMassSpectrometry

LUO Yan-xia

(Shanghai Intertek Testing Services Co., Ltd., Shanghai 200233, China)

AliquidchromatographytandemmassspectrometrydeterminationofNitrovinresiduesinanimal-originfoodwasestablished,andthemeasurementuncertaintyofthismethodwasevaluated.Theliquidchromatography-tandemmassspectrometrydeterminationofanimaloriginfoodmethodofnitrovincontentwasstudied,accordingtotheprincipleandmethodinCNAS-GL06-2006GuidanceonEvaluatingtheUncertaintyinChemicalAnalysisandJJF1059.1-2012EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement,thesourceofuncertaintyintheexperimentprocesswasanalyzed,themathematicalmodelofuncertaintyevaluationwasestablished,theresultofthesynthesisofuncertaintywascalculatedandanalyzed.Theresultsshowedthatinthedeterminationofanimaloriginfoodofnitrovincontentintheprocess,calibrationcurvefittingandtheconfigurationofthestandardsolutionwerethemainfactorsaffectingtheuncertainty,liquidchromatography-tandemmassspectrometerandrepeatabilityweresecondaryfactors.

LCMSMS;animal-originfood;nitrovin;uncertainty

羅艷霞，女，本科，主要從事食品檢測(cè)工作。

O657.7+2

A

1001-9677(2016)013-0136-05