人支氣管上皮細胞體外傳代培養方法*

段定山　馬　萍　陳　瑤

?

【實驗研究】

人支氣管上皮細胞體外傳代培養方法*

段定山1馬萍2△陳瑤3

目的探討一種對人支氣管上皮細胞株(16HBE)進行體外培養及傳代的新方法。 方法用89%1640培養液+10%FBS(胎牛血清)+1%雙抗對16HBE進行培養；待細胞貼壁后用0.25%胰酶進行消化傳代。 結果16HBE生長良好，貼壁率達80%以上，傳代后呈鋪路石樣鑲嵌。 討論用89%1640培養液+10%FBS+1%雙抗及0.25%胰酶可成功對16HBE進行傳代培養。

人支氣管上皮細胞；培養；傳代；參蘇飲

隨著人類呼吸道疾病研究的不斷深入發展，對呼吸道細胞功能的研究也越來越深入。由于HBE是呼吸系統抗感染的主要屏障，作為呼吸道上皮主要組成部分之一的HBE的來源成為課題和研究需要解決的首要問題之一。課題組前期做了益氣解表法(參蘇飲)對氣虛外感大鼠基本生存情況及肺組織相關炎癥細胞因子以及 TLR4、 NF-κB、 BD-2 表達影響的相關研究，但由于大鼠跟人類在結構功能上尚存在一定的差異，因此仍需要能直接反映人類呼吸道自身對益氣解表法(參蘇飲)敏感性的實驗，基于倫理學和人道主義以及其他道德約束，課題組不可能在患者身上直接進行研究，而體外培養的16HBE與體內原組織在形態結構以及功能活動上具有極大的相似性，能極大滿足課題需要。吳其標等研究發現應用含體積分數20%FBS的DMEM/F12培養基能實現對16HBE較好的傳代培養[1]。然而既往大量實驗認為過多的FBS會影響細胞的生長，因此作者擬采用1640加少量FBS的方法進行培養傳代。

1　實驗材料與方法

1.1實驗材料準備

1.1.1實驗細胞人支氣管上皮細胞株(16HBE)購于基爾頓生物科技(上海)有限公司。

1.1.2主要儀器設備/試劑見表1。

表1　主要儀器設備/試劑

1.1.3實驗用細胞培養液及凍存液配置方法完全培養液：89%1640培養液+10%FBS+1%雙抗(青霉素—鏈霉素)，4℃短期儲存；細胞凍存液：90%FBS+10%DMSO，即用即配。

1.2實驗步驟

1.2.1細胞培養收到細胞后首先觀察培養液顏色及透明度，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長及貼壁情況、融合率以及細胞形態結構：肉眼觀察培養液為橙紅色，清澈透明；倒置顯微鏡下可見細胞呈單層貼壁生長，融合率約為60%，形態不規則，有長須狀觸角(纖毛)伸出，細胞核大，核仁明顯，可見細胞分裂相(見封底圖1)。根據細胞生長情況棄去一半舊培養液，添加3ml左右的完全培養液。換液后，把培養瓶蓋稍微擰松半圈，并放置于細胞培養箱中，37℃、5%CO2條件下進行適應性培養。次日，用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，并更換全部培養液。培養兩天后，細胞融合率達80%以上(見封底圖2)。當細胞的貼壁融合率達80%以上后，進行消化傳代。

1.2.2細胞消化傳代直接傾倒法棄盡舊培養液，PBS液漂洗細胞2次，每次用液約2ml。漂洗時輕輕晃動PBS使其漂洗充分。吸盡PBS后，每瓶加入1ml 0.25%胰酶消化液(含0.02%EDTA)，輕輕晃動使其均勻地覆蓋于細胞表面。擰緊培養瓶蓋，立即置于37℃孵箱，輕輕晃動后靜置1min左右。取出后于倒置顯微鏡下觀察消化情況。當細胞間連接松散、細胞質開始回縮、形態變圓、有單個或成片細胞浮起現象時立即加入3ml～4ml完全培養液終止消化。若仍有少量細胞貼附于培養瓶壁，可輕晃培養液、輕敲培養瓶側壁或用加樣槍輕輕吹打培養瓶底部收集所有細胞。盡量將全部細胞懸液用加樣槍吸入10ml離心管中，擰緊離心管蓋并以離心機轉速1000r/min離心5min。離心后棄盡上清液，加入適量完全培養液，輕輕吹打混勻細胞團塊，將細胞懸液分裝至2～3個培養瓶中。添加完全培養液至每瓶5ml左右，輕輕混勻，于顯微鏡下觀察細胞接種密度。后將培養瓶蓋稍擰松，置于孵箱中，輕輕晃動使細胞懸液呈均勻分布，于37℃，5%CO2條件下進行培養。培養過程中分別于0h、12h、1～2d、2～3d、3～5d時間點作好鏡下圖片記錄。

1.2.3細胞凍存當細胞融合到80%以上時，按1.2.2所述方法消化收集細胞。加入適量細胞凍存液，輕輕搖晃使細胞均勻融入凍存液中。用1ml管使每瓶細胞分別對應凍存。封口標記后梯度降溫凍存：4℃(20～30min)；用棉花包裹后置-80℃冰箱過夜；次日將凍存管緩慢放入液氮罐中，以便長期儲存。

1.3實驗中注意事項

1.3.1在細胞培養過程中，應每天觀察培養液的顏色和透明度，以判定細胞是否正常生長和培養液內營養物質的消耗情況以及有無污染。并在倒置顯微鏡下用低倍鏡(×100)觀察細胞的增殖與融合情況，然后用高倍鏡(×400)仔細觀察細胞形態并做好記錄。根據細胞接種密度與生長情況，一般隔天換一次液以保證細胞生長和新陳代謝所需。

1.3.2消化過程中，需充分洗盡含血清的培養液，加入消化液后，需將培養瓶放入37℃培養箱中促進消化。消化時間應控制在2min以內，時間過長易導致后期培養時細胞生長狀況變差。

1.3.3細胞凍存是實驗中的關鍵環節研究表明16HBE較為嬌弱，必須嚴格控制凍存的溫度、時間等條件。本實驗選用的凍存液為90%FBS加10%DMSO，既能為細胞提供充足的營養條件，又能防止溫度驟降形成冰晶造成的傷害。在凍存時，可先將凍存管放入4℃冰箱靜置半小時以內，或直接用棉花包裹凍存管直接放入-80℃冰箱；-80℃過夜后再移入液氮罐此種方法可長期儲存細胞。-80℃適用于短期儲存細胞，一周內細胞活性尚可，復蘇存活率可達80%。

1.3.4在整個實驗過程中，一定要始終注意“有菌觀念，無菌操作”，尤其在使用胰酶消化液過程中應盡量避免消化液被細菌污染。

2　實驗結果

傳代后3～4h時，細胞開始出現貼壁現象；12h內幾乎全部貼壁并開始出現分裂相；1～2天內分裂呈團簇狀或開始有拉網現象，接著連接成片狀(見封底圖3)；最后呈鋪路石樣鑲嵌滿整個視野。傳代過程中細胞的長觸角逐漸消失，呈多邊形態(見封底圖4～8)。實驗發現細胞的融合快慢依接種密度不同而異，按課題需要將細胞進行1傳2～4，融合率達80%以上需3～5天。

3　實驗結論

選用89%1640培養液+10%FBS+1%雙抗成功培養了16HBE，為后續實驗做足準備。實驗表明，RPMI1640培養液加10%FBS能為其提供較好的生長環境。16HBE貼壁較為牢固，實驗中選用的消化液為0.25%胰酶(含0.02%EDTA)，消化能力較強，能較好輔助完成傳代培養。

4　討論

隨著呼吸道疾病相關研究的不斷發展，能直觀反映人體呼吸道抗微生物或免疫功能的細胞研究將會是未來科研的一大走向。秦曉群等研究認為人氣道上皮的結構完整性缺陷或功能紊亂是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等氣道高反應性疾病的啟動環節[2]。張志紅等研究發現PM2.5能對支氣管上皮細胞造成氧化損傷，并可能通過氧化應激調節上皮細胞JAK/STAT信號通路和相關細胞因子的產生[3]。既往認為血清會抑制體外培養的HBE的生長，國內外亦多采用無血清培養基對其進行培養[4、5]，而實驗則采用了89%1640培養液+10%FBS的方法，同樣成功實現了極好的傳代培養效果。由于經費及人力的不足，本實驗除了對16HBE細胞進行外觀和數量的觀察外，還缺少對相關指標的檢測和對比。

[1]吳其標，盧金福，尹耀庭，等.人支氣管上皮細胞的體外培養[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011, 15(50)：9331-9334.

[2]秦曉群，向陽，劉持,等.支氣管上皮細胞在氣道高反應中的作用[J]. 生理學報, 2007，59(4):454-464.

[3]徐貞貞，張志紅，馬曉燕,等. PM2.5通過氧化應激對人支氣管上皮細胞JAK/STAT信號通路的影響[J].衛生研究，2015,44(3)：451-455

[4]唐雋,馬玲國,何發堯,等.氣管黏膜上皮細胞無血清培養的初步實驗研究.[J].山東大學耳鼻喉眼學報,2005,19(6):403-406.

[5]Paquette JS, Tremblay P, Bernier V, et al. Production of tissue-engineered three-dimensional human bronchial models In Vitro Cell Dev Biol Anim[J].Vitro Cellular & Developmental Biology Animal,2003,39(5-6):213-220.

Method for Subculture of Human Bronchial Epithelial Cell 16HBE in Vitro Condition

DUAN Dingshan1MA Ping2CHEN Yao3

(1.Department of Internal Medicine of TCM, Chengdu Qingbaijiang District Hospital of TCM, Sichuan, Chengdu 610300, China;2.Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan, Chengdu 610001, China; 3.Grade 2014 Graduate, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610001, China)

ObjectiveTo discuss a new method on subculture 16HBE cell in vitro condition. Methods16HBE were cultured in 89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and cultured with trypsin enzyme-digesting technique and passaged in vitro. Results16HBE grown well and reached an adhesive rate of 80%, mosaicked like paving stone after passage. Conclusions89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and trypsin enzyme-digesting technique can successfully culture and passage 16HBE.

16HBE; Culture; Passage; Shensu decoction

國家自然科學基金資助項目(No.81173365)

1.四川省成都市青白江區中醫醫院中醫內科(成都 610300)；2.成都中醫藥大學基礎醫學院病原微生物及免疫學教研室(成都 610001)；3.成都中醫藥大學基礎醫學院碩士研究生2014級(成都 610001)

△

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.15.021

1003-8914(2016)-15-2186-03

(本文校對：劉莉2015-11-16)