反向電壓下場放大進(jìn)樣毛細(xì)管電泳分析磺胺類藥物

孫　彤，張　營，翁前鋒

(遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧　大連　116029)

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反向電壓下場放大進(jìn)樣毛細(xì)管電泳分析磺胺類藥物

孫彤，張營，翁前鋒

(遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連116029)

采用反向電壓下場放大進(jìn)樣富集技術(shù)，建立了四種磺胺類藥物的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析方法。確立了優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，電泳緩沖液為22.5 mmol/L Na2HPO4-0.8 mmol/L CTAB-18%ACN，pH 8.70，樣品溶于0.1 mmol/L NaOH溶液，電泳電壓：-20 kV，檢測電位：1.10 V，進(jìn)樣方式為-13 kV×20 s。四種磺胺類藥物在該方法條件下檢出限可達(dá)10-9～10-10mol/L水平。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳；反向電壓；場放大進(jìn)樣；磺胺類藥物

磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病[1-2]。其性質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)量大、品種多、價(jià)格低，因此畜牧養(yǎng)殖業(yè)中常將其作為飼料添加劑或動(dòng)物疾病治療藥物。但是磺胺藥攝入過多會(huì)損害腎臟，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和引起胃腸道反應(yīng)，且可能致癌[3]，許多國家和地區(qū)嚴(yán)格限制磺胺類藥物在食品中的最大殘留量(例如，在歐洲地區(qū)和中國臺(tái)灣限量100 μg/kg[4])。由于它對(duì)環(huán)境和健康潛在的威脅，對(duì)食品、動(dòng)物組織和環(huán)境水樣等復(fù)雜基體中磺胺類藥物殘留量的分析已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。

目前測定各種基質(zhì)中磺胺類藥物的主要分析方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳(CE)和氣相色譜等[5-8]。CE因?yàn)槠浞蛛x效能高、分離時(shí)間短、樣品用量少和有機(jī)溶劑用量很少等特點(diǎn)，較其它方法有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。在線富集方法結(jié)合CE技術(shù)聯(lián)用可以顯著提高分析靈敏度，適用于低含量藥物殘留的分析。

本文建立了一種磺胺類藥物的毛細(xì)管電泳分析新方法。采用電化學(xué)安培檢測，反向電壓下，毛細(xì)管區(qū)帶電泳結(jié)合場放大進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)了對(duì)四種常見磺胺類藥物的檢測。在優(yōu)化條件下，四種磺胺類藥物在15 min內(nèi)可以完全分離。磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲基嘧啶四種檢測物質(zhì)在5×10-8～5×10-6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)分別為0.9900、0.9766、0.9837、0.9915。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

自組裝毛細(xì)管電泳裝置(配有JF-01電化學(xué)伏安檢測器),山東省化工研究院；2003高壓電源,北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司；熔融石英毛細(xì)管柱(i.d. 25 μm×60 cm), 河北永年光導(dǎo)纖維廠；KQ2200DB數(shù)控型超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司；三電極體系；碳纖維微盤電極為工作電極；飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為輔助電極。

1.2試劑和溶液

磺胺嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺二甲基嘧啶(SM2),Aladdin Chemstry Co., Ltd.。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、磷酸氫二鈉、乙腈(ACN),購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。電泳緩沖溶液為22.5 mmol/L Na2HPO4-0.8 mmol/L CTAB-18%ACN，并通過0.45 μm濾膜過濾。

1.3電泳過程

每次毛細(xì)管使用前分別用1 mol/L NaOH(5 min)，水(5 min)，乙腈(5 min)，水(5 min)，電泳緩沖液(5 min)沖洗毛細(xì)管。其他條件在正文和圖表中詳細(xì)介紹。

2　結(jié)果與討論

2.1方法原理

電泳緩沖液中含有不高于臨界膠束濃度的陽離子表面活性劑CTAB, 因此分離模式為毛細(xì)管區(qū)帶電泳。當(dāng)毛細(xì)管兩端施加負(fù)高壓，電滲流方向由高壓負(fù)極指向正極，即電滲流反向。磺胺類藥物在堿性溶液中帶負(fù)電荷，電泳方向指向高壓正極，與電滲流反向一致。此時(shí)，待測樣品的遷移速度等于電滲流的速度與電泳速度之和，如圖1所示。場放大進(jìn)樣是將樣品溶解于低電導(dǎo)的溶劑中，用高電導(dǎo)的電泳緩沖溶液充滿毛細(xì)管柱，在電動(dòng)進(jìn)樣模式將樣品引入毛細(xì)管。在高電壓的作用下，因電泳緩沖液與樣品溶劑存在電導(dǎo)率差異，因樣品溶劑電導(dǎo)率小且處于進(jìn)樣口端，故該處電場強(qiáng)度高于電泳緩沖液灌注的毛細(xì)管柱內(nèi)部電場強(qiáng)度，故在此區(qū)域內(nèi)帶負(fù)電荷樣品的遷移速率快，當(dāng)待測分析物遷移到樣品溶液與電泳緩沖液的交界處，遷移速率由大驟然變小，樣品在此處得以富集，濃度提高。

圖1　實(shí)驗(yàn)中反向電壓下，場放大進(jìn)樣毛細(xì)管電泳示意圖

2.2電泳緩沖液 pH的影響

圖2　不同pH對(duì)于待測樣品的分離影響的毛細(xì)管電泳圖

實(shí)驗(yàn)考察了pH值在7.00～10.75范圍內(nèi)待測組分的分離情況，結(jié)果如圖 2所示。隨著pH值的增大，四種待測組分出峰并逐漸分離，在pH為8.7時(shí)，四種樣品可以達(dá)到完全分離，且系統(tǒng)峰的出峰時(shí)間距樣品峰出峰時(shí)間較遠(yuǎn)，對(duì)樣品峰干擾小。若繼續(xù)加大電泳緩沖液的pH，可發(fā)現(xiàn)后兩種樣品峰混合在一起分離不開。故本實(shí)驗(yàn)最佳pH值為8.7。

2.3電泳緩沖液中磷酸鹽濃度的優(yōu)化

緩沖液中磷酸鹽的濃度會(huì)影響電滲流。實(shí)驗(yàn)考察了磷酸鹽濃度在17.5～30 mmol/L時(shí)對(duì)組分分離及峰電流的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著磷酸鹽濃度的增加，樣品峰由混合峰逐漸分離。當(dāng)磷酸鹽濃度為22.5 mmol/L時(shí)，所測四種磺胺類藥物可以完全分離；當(dāng)磷酸鹽濃度大于22.5 mmol/L時(shí)，組分峰電流卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以選擇磷酸鹽濃度為22.5 mmol/L。

2.4CTAB濃度的優(yōu)化

CTAB的濃度是影響樣品組分分離程度與組分峰電流的重要因素。實(shí)驗(yàn)中考察了CTAB濃度在0.2～1.3 mmol/L時(shí)對(duì)組分峰電流的影響。當(dāng)CTAB的濃度在0.2～0.6 mmol/L時(shí)樣品是混合在一起分不開的，當(dāng)CTAB濃度增加至0.8 mmol/L時(shí)，四種磺胺類藥物可以完全分離且樣品峰電流達(dá)到最高值，繼續(xù)加大CTAB的濃度，組分峰電流呈下降趨勢(shì)。綜上所述，實(shí)驗(yàn)選擇CTAB濃度為0.8 mmol/L。

2.5電泳溶液中有機(jī)溶劑的優(yōu)化

圖3　ACN百分比對(duì)組分峰電流的影響

有機(jī)溶劑的添加，可以改善電泳緩沖液pH、焦耳熱效應(yīng)等因素對(duì)樣品組分分離情況的影響，在電泳緩沖液pH為8.70，組成為22.5 mmol/L Na2HPO4-0.9 mmol/L CTAB時(shí)，考察了不添加有機(jī)物，添加甲醇、乙腈對(duì)四種磺胺類藥物分離程度及峰型的影響。不添加有機(jī)物與加入8%甲醇的體系，四種樣品并沒有全部出峰，加入8%乙腈的體系，四種待測組份全部出峰且分離，但峰形不好。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為添加的有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)考察了電泳緩沖液中ACN的百分比在2%～20%對(duì)組分峰電流的影響，如圖3所示。隨著ACN濃度的增加，后兩個(gè)組分峰峰型逐漸尖銳，隨著ACN百分比不斷的增加，組分峰的拖尾現(xiàn)象逐漸消失，當(dāng)ACN的百分比達(dá)到18%時(shí)，四種樣品完全分離且無拖尾現(xiàn)象，繼續(xù)增大ACN的百分比四種樣品峰混合在一起。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選擇ACN百分比為18%。

2.6樣品溶劑的考察

圖4　樣品溶劑對(duì)富集效果影響的毛細(xì)管電泳圖

場放大進(jìn)樣的原理是將樣品溶于低電導(dǎo)的溶液中，而電泳緩沖液的電導(dǎo)高，因樣品區(qū)與緩沖液區(qū)存在電導(dǎo)差，使得

待測物質(zhì)的遷移速度由快突然驟減，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品的富集。本實(shí)驗(yàn)分別以水和稀堿作為樣品的溶劑，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)樣品溶劑為0.1 mmol/L NaOH時(shí)，四種磺胺類藥物更易溶于稀堿且峰型較好，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)的樣品溶劑為0.1 mmol/L NaOH溶液。

2.7重現(xiàn)性、線性范圍和檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)以便于對(duì)系統(tǒng)的重現(xiàn)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。各分析物的峰電流及遷移時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表1所示。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好，結(jié)果可靠，方法可行。

表1　各分析物峰電流及遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，得到4種磺胺類藥物峰電流(y)與濃度(x)的線性回歸方程及檢出限(三倍噪音法)，如表2所示。

表2　各分析物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

3　結(jié)　論

反向電壓下毛細(xì)管區(qū)帶電泳聯(lián)合樣品堆積富集技術(shù)對(duì)四種磺胺類藥物的殘留進(jìn)行了分析檢測。本實(shí)驗(yàn)以22.5 mmol/L磷酸鹽為電泳緩沖液體系，CTAB為電滲流改性劑，18%的乙腈為有機(jī)添加劑，在最優(yōu)條件下，對(duì)所建立實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，本方法方便簡單，靈敏度高，對(duì)所檢測的分析樣品有很好選擇性。為磺胺類藥物的檢測提供了一種新的可行性方法。

[1]Lu K H, Chen C Y, Lee M R. Trace determination of sulfonamides residues in meat with a combination of solid-phase microextraction and liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Talanta, 2007, 72(3): 1082-1087.

[2]Pleasance S, Thibault P, Kelly J. Comparison of liquid-junction and coaxial interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometry with application to compounds of concern to the aquaculture industry[J]. J Chromatogr A,1992, 591:325-339.

[3]王翔,鄧曉軍,宋國新,等.食品中磺胺類獸藥殘留前處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2009, 30(7): 254-257.

[4]張寅艷,靳淑萍,李自成,等.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測法測定飼料中的磺胺類藥物[J].分析試驗(yàn)室, 2010, 29(3): 1-5.

[5]董丹,邵兵,吳永寧,等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法測定雞肉中17種磺胺類藥物的殘留[J].色譜, 2005, 23(4): 404-407.

[6]王桂芳,張守堯,沈霞.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測定復(fù)方磺胺甲噁唑片中兩組分的含量[J].西北藥學(xué)雜志, 2001, 16(2): 51-52.

[7]項(xiàng)智鋒,陳軍,張安邦.牛奶中6種磺胺類藥物殘留的HPLC測定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室, 2008, 25(5): 935-938.

[8]陳蓉,郭懷忠,孫毓慶,等.短毛細(xì)管區(qū)帶電泳快速測定增效聯(lián)磺片中三組分含量[J].藥物分析雜志, 2004, 24(2): 190-193.

On-line Concentration by Field-enhanced Sample Injection with Reverse Voltage in Capillary Zone Electrophoresis for the Analysis of Sulfonamides

SUNTong,ZHANGYing,WENGQian-feng

(Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116029, China)

A method based on capillary zone electrophoresis combined field-enhanced injection with reverse voltage was developed for the simultaneous determination of sulfonamide antibiotics. Optimized experimental conditions were established as follows: lectrophoresis buffer, 22.5 mmol/L phosphate solution-0.8 mmol/L CTAB at pH 8.70, 18%(V/V) acetonitrile as organic additive, 0.1 mmol/L NaOH as sample solvent, electrophoresis voltage was -20 kV, detect potential was 1.1 V, electrokinetic injection was 20 S at -13 kV. Under the optimum conditions, the limit of detections (LODs) of four kinds of drugs reached to about 10-9～10-10mol/L.

capillary zone electrophoresis; field-enhanced injection; reverse voltage; sulfonamides

孫彤，女，碩士研究生，主要從事毛細(xì)管電泳分析研究。

翁前鋒。

O657.8

A

1001-9677(2016)012-0130-03