人血清白蛋白對菁染料超分子聚集體的調控研究*

趙麗媛，曹佳佳，楊丹琦，肖情情，王亞男，孫　鑫，陳宏博，蘭　玲，張秀鳳

(華北理工大學化學工程學院，河北　唐山　063009)

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人血清白蛋白對菁染料超分子聚集體的調控研究*

趙麗媛，曹佳佳，楊丹琦，肖情情，王亞男，孫鑫，陳宏博，蘭玲，張秀鳳

(華北理工大學化學工程學院，河北唐山063009)

采用紫外吸收光譜和熒光光譜研究了菁染料MTC超分子聚集體與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。研究表明在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，MTC主要以J-聚集體的形式存在而非單體。當HSA存在時，J-聚集體部分分解轉變為H-聚集體。同時，MTC對HSA的內源熒光有較強猝滅作用，猝滅機制屬于生成復合物的靜態猝滅，二者結合常數為6.86×105M-1，結合位點數為1。MTC的存在導致了色氨酸所處微環境極性增大，疏水性降低，肽鏈變得更加伸展。

人血清白蛋白；菁染料；聚集體；熒光猝滅

蛋白質存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構和功能物質，它參與了幾乎所有的生命過程。人血清白蛋白(Human Serum Album, HSA)是由585個氨基酸殘基組成的單肽鏈心形蛋白質，分子量約66500，其中約67%的HSA為 α-螺旋結構[1]。HSA主要存在于血漿和組織液中，其濃度達到了40 mg/mL。HSA可以儲存和運輸許多內源和外源物質(小分子物質)，如膽紅素、脂肪酸、激素、陰陽離子、藥物、染料、量子點和配合物等[2-3]。進入生物體內的藥物要通過血漿的儲存和轉運到達受體部位發揮藥效，所以從分子水平研究藥物小分子與蛋白質的相互作用不僅有助于了解藥物的儲存、轉運和代謝過程，也為高活性藥物小分子的設計和開發提供了有價值的信息。

菁染料作為一類熒光染料分子，由于其具有光譜范圍寬、摩爾消光系數高、高熒光量子產率等優點[4]，因此它不僅在傳統的感光、光電領域有廣泛應用，在生物醫學以及腫瘤治療方面也體現出廣闊的應用前景。在溶液和一些基質中，菁染料分子由于分子骨架及取代基的不同，通過分子間范德華力可以自發的形成多種狀態的超分子聚集體，能夠以單體、二聚體、H-聚集體和J-聚集體等多種形式存在。菁染料可以以蛋白質、DNA等生物大分子為模板進行超分子組裝和調控，用菁染料聚集體設計成探針實現了對HSA可視化和熒光的雙重檢測。

1　實　驗

1.1儀器和試劑

TU-1901型紫外可見吸收光譜儀，北京普析公司；F-7000型熒光光譜儀，上海葉拓儀器儀表有限公司。

菁染料MTC[3，3’-二(3-磺丙基)-4,5,4’,5’-二苯并-9-甲基-噻碳菁染料三乙胺鹽(C38H45N3O6S4)]按Hamer[5]和Ficken[6]建議的方法合成，使用前經甲醇重結晶，質量通過核磁共振、質譜、紅外光譜和元素分析鑒定，結構如圖1所示。

圖1　MTC的化學結構示意圖

人血清白蛋白(HSA),生物試劑 Sigma公司；鹽酸(HCl,分析純),天津市凱信化學工業有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris),上海晶純生化科技股份有限公司；實驗所用水均為超純水。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的制備

實驗所用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4，每升溶液中含有1.211 g Tris)。稱量一定量的菁染料MTC用少量甲醇溶解，再用Tris-HCl緩沖溶液稀釋到所需體積及濃度得到染料母液。準確稱量一定量的HSA樣品直接用緩沖溶液稀釋成HSA母液，儲存于4 ℃冰箱內。將一定體積的人血清白蛋白母液和菁染料MTC溶液混合后用Tris-HCl緩沖溶液定容配制一系列不同濃度比的MTC和HSA混合溶液并搖勻，避光靜置2 h后進行光譜試驗。

1.2.2光譜實驗測定

紫外可見吸收光譜：掃描波長范圍為400～800 nm，掃描間隔為1 nm。

熒光光譜：實驗中采用的激發光源為氘燈，激發波長分別為280 nm和295 nm，發射波長為300～500 nm，掃描速度2400 nm/min，激發光與發射光的狹縫寬度均設為5 nm，電壓為400 V。

2　結果與討論

2.1MTC-HSA紫外吸收光譜分析

圖2　不同濃度的HSA對菁染料MTC的紫外可見吸收光譜

在濃度為10 mM的Tris-HCl緩沖溶液中，MTC主要以幾個或者多個染料分子中的疏水平面堆積在一起形成的J-聚集體形式存在。由圖2可知，將HSA加入到MTC自組裝形成的J-聚集體中，J-聚集體的吸收值逐漸降低，說明J-聚集體逐漸分解，并以HSA 為模板組裝形成了H-聚集體。同時，我們發現即使在高濃度HSA溶液體系中, J-聚集體的吸收峰值雖然較低，但并沒有完全消失，說明J-聚集體也不能完全地轉化為H-聚集體。一般來說，相鄰的菁染料單體分子間在范德華作用力下自組裝形成J-聚集體，同HSA相互作用時，由于靜電力和疏水作用力而被部分分解，然后以HSA為模板組裝成單體或H-聚集體。

2.2MTC對HSA的熒光猝滅

2.2.1熒光猝滅光譜

熒光光譜法是研究小分子配體與蛋白質的相互作用的方法之一。通過熒光光譜研究，可以獲得蛋白質與小分子之間結合作用的信息，如結合位點、結合常數、構象變換及作用力類型等。HSA中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸 (Phe) 三種芳香族氨基酸而屬于內源性熒光物質[7]。當激發波長為280 nm 時，熒光主要源自Trp和 Tyr殘基。而當激發波長為295 nm時，蛋白質熒光主要源自于Trp殘基。

由圖3可知，在溫度293 K，pH=7.4的條件下，隨著MTC濃度增大，用280 nm和295 nm波長激發的HSA的熒光強度都逐漸降低，表明MTC和HSA發生了相互作用。同時，在295 nm激發狀態下，最大發射波長明顯紅移，表明MTC與HSA發生了相互作用并且使色氨酸所處環境極性增大，疏水性降低，肽鏈的伸展程度變大，HSA分子構象發生改變，MTC形成的J-聚集體是在HSA的疏水腔中進行了聚集狀態的轉變。

圖3　不同濃度的菁染料MTC對HSA(5 μM)的熒光發射光譜

2.2.2熒光猝滅機制

熒光猝滅是指熒光物質與猝滅劑之間所發生的導致熒光強度降低的物理或化學作用。基于蛋白質與小分子之間相互作用的熒光猝滅過程，可分為靜態猝滅和動態猝滅兩種機制。靜態猝滅是指熒光體與猝滅劑通過疏水作用、靜電作用和氫鍵等弱作用力結合生成無熒光或熒光強度較低的復合物而導致熒光猝滅的過程。動態猝滅是指猝滅劑和熒光體物質間通過碰撞而使得熒光猝滅的過程。為證實MTC與HSA作用的熒光猝滅過程，將此過程按動態過程處理，根據Stern-Volmer方程[8]：

(1)

式中：F0，F分別為單獨HSA和存在不同濃度MTC下熒光發射峰強度；Kq為生物大分子的熒光猝滅速率常數；τ0為無猝滅劑存在的情況下蛋白質的熒光壽命(τ0=10-8s)[9]；[Q]為猝滅劑的濃度；Ksv為動態猝滅常數。

以F0/F對[Q]做線性回歸，可得到MTC與HSA作用的Stern-Volmer曲線(圖4)。根據猝滅曲線的斜率可得熒光猝滅常數Ksv和猝滅速率常數Kq分別為5.07×104M-1和5.07×1012M-1s-1，猝滅速率常數遠大于熒光分子最大擴散控制的碰撞猝滅速率常數2×1010M-1s-1，由此可知，菁染料MTC對HSA熒光猝滅過程不是因分子間碰撞而引起的動態猝滅，而是非熒光復合物形成而產生的靜態猝滅過程。

圖4　MTC-HSA體系的Stern-Volmer方程擬合圖

2.2.3結合常數和結合位點的計算

由于MTC對人血清白蛋白的熒光猝滅是一個靜態猝滅過程，小分子與蛋白質之間的結合常數Ka和結合位點數n可由以下公式獲得:

(2)

式中，Ka為結合常數；n為結合位點數。以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]進行線性擬合，得到熒光猝滅的對數曲線(圖5)。由對數曲線的截距和斜率分別可得菁染料MTC與HSA作用的結合常數Ka和結合位點數n值分別為6.86×105M-1和1.24，表明菁染料HSA對MTC具有很強的結合能力，n值近似等于1，說明MTC與HSA形成1:1的復合物，MTC在人血清白蛋白上主要有一個特異性的結合位點。

圖5　不同濃度MTC對HSA熒光猝滅的對數曲線

3　結　論

采用紫外吸收光譜研究了HSA對MTC聚集體的調控作用，表明隨著HSA濃度的增大，MTC形成的J-聚集體逐漸分解并以HSA為模板組裝為H-聚集體。通過熒光光譜研究發現HSA對MTC有較高的親和力，MTC對HSA的熒光猝滅機制為靜態猝滅過程。MTC在HSA上主要存在一個特異性結合位點，形成1:1的復合物。同時，MTC的加入導致了色氨酸所處微環境極性增大，疏水性降低，肽鏈的伸展程度變大，蛋白質結構變得更加疏松。

[1]唐江宏.有機小分子與人體血清蛋白的相互作用研究[D].蘭州:蘭州大學, 2006.

[2]王寧,劉忠英,胡秀麗,等.黃芩類藥物與人血清白蛋白的相互作用[J]. 高等學校化學學報,2011,32(2):241-245.

[3]Xu TC, Guo XJ, Zhang L, et al.Multiple spectroscopic studies on the interaction between olaquindox, a feed additive,and bovine serum albumin[J].Food.Chem.Toxicol,2012, 50:2540-2546

[4]張亞洲.菁染料的超分子組裝及手性誘導研究[D].北京:中國科學院研究生院,2007.

[5]Hamer F M. The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Interscience[M].New York, 1964: 148-200.

[6]Ficken G E. The Chemistry of Synthetic Dyes[M]. Academic Press New York, 1971: 228-240.

[7]尹燕霞,向本瓊,佟麗.熒光光譜法在蛋白質研究中的應用[J].實驗技術與管理,2010,27(2):34-37.

[8]張冰衛,李博,夏文水,等.用熒光光譜法研究分子間結合常數和結合位點數時的公式選擇[J].藥學進展,2011,35(7)： 296-303.

[9]吳根華,汪婕,陳金龍,等.熒光光譜法研究鋅(Ⅱ)存在下諾氟沙星與牛血清白蛋白的結合作用[J].光譜學與光譜分析,2008,28(4):913-916.

Investigation on the Supramolecular Regulation of Cyanine Dyes by Human Serum Albumin*

ZHAOLi-yuan,CAOJia-jia,YANGDan-qi,XIAOQing-qing,WANGYa-nan,SUNXin,CHENHong-bo,LANLing,ZHANGXiu-feng

(College of Chemical Engineering, North China University of Science and Technology, Hebei Tangshan 063009, China)

The interaction of human serum albumin (HSA) and aggregation of cyanine dye MTC was studied using UV absorption and fluorescence spectroscopy. The research showed that MTC existed not as isolated monomer but rather in the formation of J-aggregation in the pH 7.4 Tris-HCl buffer system. In the presence of HSA, the J-aggregation was partially transformed into H-aggregation. Meanwhile, there was a strong fluorescence quenching of HSA by MTC. The quenching mechanism was a static quenching by forming the HSA-MTC complex. The binding constant Kaand the number of binding site were 6.86×105M-1and 1, respectively. The presence of MTC led to the hydrophobic nature around tryptophan residue of HSA become smaller, polarity would increase and the peptides became more stretched.

human serum albumin; cyanine dye; aggregation; fluorescence quenching

華北理工大學化學工程學院大學生創新創業訓練計劃項目(2015HG03)。

趙麗媛(1994-)。女。

張秀鳳(1978-)，女，博士，華北理工大學化學工程學院教授，研究方向為載藥體系研究。

O657.3

A

1001-9677(2016)012-0087-03