間接糖基化馬蹄金素衍生物的合成及抗乙肝病毒活性研究

徐廣燦, 袁　潔, 劉青川, 黃正明, 梁光義, 徐必學

(1. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室, 貴陽 550002;2. 貴陽中醫學院藥學院, 貴陽 550002;3. 中國人民解放軍第三○二醫院, 北京 100039;4. 新疆醫科大學厚博學院, 克拉瑪依 834000)

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間接糖基化馬蹄金素衍生物的合成及抗乙肝病毒活性研究

徐廣燦1,2, 袁潔1,4, 劉青川3, 黃正明3, 梁光義1,2, 徐必學1

(1. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室, 貴陽 550002;2. 貴陽中醫學院藥學院, 貴陽 550002;3. 中國人民解放軍第三○二醫院, 北京 100039;4. 新疆醫科大學厚博學院, 克拉瑪依 834000)

以二縮三乙二醇或三縮四乙二醇為連接臂, 通過間接引入具有肝靶向性的D-半乳糖配基的方法, 設計合成了6個半乳糖糖基化修飾的肝靶向馬蹄金素(MTS)衍生物; 通過1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY, HMQC和ESI-MS對其結構進行了表征; 并以HepG2 2.2.15為細胞模型初步評價了目標化合物的抗乙肝病毒(HBV)活性. 結果表明, 所有目標化合物對HBV DNA的復制均有抑制作用, 且具有一定的量效關系. 化合物15b的體外抗HBV活性最好, 后期研究將選用其進行小鼠體內組織分布實驗, 并與原型化合物以及Y101體內組織分布情況進行比較研究, 以驗證半乳糖基的引入能否提高MTS衍生物的肝靶向性.

肝靶向; 半乳糖; 馬蹄金素衍生物; 抗HBV活性

乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的, 亞太地區是HBV攜帶的高頻區, HBV攜帶者約占全世界的1/3[1]. 目前, 對HBV的治療主要以藥物治療為主[2], 但臨床使用的藥物易產生耐藥及停藥“反跳”等缺陷, 療效不甚理想[3,4]. 馬蹄金素(MTS, 結構見圖1)由本課題組從治療肝炎的民族藥馬蹄金中分離得到, 具有較好的抗HBV活性[5]. 前期研究[6～9]以其為先導化合物, 設計合成了系列抗HBV活性較好的MTS衍生物; 并優選得到1個MTS衍生物(研發代號Y101, 結構見圖1), 目前已進入Ⅰ期臨床試驗. 對Y101的初步藥物代謝動力學實驗結果表明, 其在體內組織中分布廣泛, 而肝臟藥物濃度不高. 因此, 為提高該類衍生物的肝臟藥物濃度, 以降低不良反應, 增強其抗HBV活性, 本文擬對MTS衍生物進行肝靶向設計與合成.

Fig.1　Chemical structures of MTS(A) and Y101(B)

去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)最初由Ashwell等[10～12]發現, 它能迅速清除血循環中末端為β-1,4鏈半乳糖的糖蛋白, 因此被識別和定義. Hashida等[13]通過對比多種肝靶向途徑, 證實ASGP-R介導的途徑靶向作用最好, 對肝臟親和性較高, 是最具研發和應用價值的肝靶向給藥系統因此受到關注[14～16].

Fig.2　　　　General structure of hepatic targeting MTS derivatives

前文[17]對MTS衍生物進行了直接糖基化肝靶向設計合成, 所得目標化合物的體外抗HBV DNA抑制率不佳. 對糖生物化學中“簇集效應”的研究表明, 衍生物的活性、糖基及受體的親和力均與連接臂的長短和糖基之間的空間位置有關[18]. Bieesen等[19]發現糖配基及受體親和力大小主要與連接臂長度有關, 臂長為2 nm時親和力至少為0.4 nm的200倍; Dean等[20]合成了一系列β-乳糖通過碳鏈連接的衍生物, 發現其活性也與連接臂長度密切相關. 據此, 通過改變糖基配體與MTS衍生物之間的空間結構, 我們[21]設計合成了新型的以乙醇胺為連接臂進行間接糖基化的肝靶向MTS衍生物; 體外抗HBV實驗結果表明, 該類肝靶向MTS衍生物體外抗HBV活性比直接糖基化肝靶向MTS衍生物有所提高. 基于此, 為進一步探討連接臂長短對肝靶向MTS衍生物活性的影響規律, 本文以二縮三乙二醇或三縮四乙二醇為連接臂設計合成了系列肝靶向MTS衍生物(結構通式見圖2).

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

乙酸酐(Ac2O, 分析純)購自上海四赫維化工有限公司; 三氟化硼乙醚(BF3·Et2O, 含三氟化硼48%)、對甲基苯磺酰氯(TsCl, 純度99%)、三氟乙酸(TFA, 純度99.9%)和二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O, 純度99%)]購自百靈威科技有限公司; 氯甲酸異丁酯(IBCF, 純度98%)購自阿法埃莎中國化學有限公司;N-甲基嗎啡啉(NMM, 純度99%)購自上海邁瑞爾化學技術有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 分析純, 用分子篩干燥24 h后待用)和二氯甲烷(CH2Cl2, 分析純, 用氫化鈣回流4 h后蒸餾待用)購自上海國藥集團化學試劑有限公司.

Inova 400 MHz超導核磁共振儀(美國Varian公司); WIPM WNMR-I 500 MHz超導核磁共振儀(中國科學院武漢物理與數學研究所); HP-5793型質譜儀和HP1100型液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS, 美國Hewlett-Packard公司); 柱色譜硅膠(300～400目)及高效薄層板(青島海洋化工廠).

1.2實驗過程

目標化合物15a～15f的合成路線如Scheme 1所示.

n1=2,3; n=3,415a: R1=H, R2=4-F, n=3; 15b: R1=H, R2=3-I, n=3; 15c: R1=OCH2CH3, R2=4-Cl, n=3;15d: R1=H, R2=4-F, n=4; 15e: R1=H, R2=3-I, n=4; 15f: R1=OCH2CH3, R2=4-Cl, n=4Scheme 1　Synthetic routes of target compounds 15a—15f(1) Ac2O, CH3COONa, 140 ℃; (2) 4-methylphenylsulfonyl chloride, pyridine, r.t.; (3) 0.4 nm molecular sieves, BF3·Et2O, CH2Cl2, 0 ℃ to r.t.; (4) phthalimide potassium, DMF, 110 ℃; (5) N2H4·H2O, MeOH, H2O, 80 ℃; (6)(Boc)2O, NaHCO3, EtOH, r.t.; (7) Ac2O, pyridine, r.t.; (8) TFA, CH2Cl2, 0 ℃; (9) IBCF, NMM, CH2Cl2/DMF, 0 ℃ to r.t.; (10) (a) NaOH, DMF, r.t.; (b) IBCF, NMM, CH2Cl2/DMF, 0 ℃ to r.t.; (11) NaOH, DMF, r.t.; (12) IBCF, NMM, CH2Cl2/DMF, 0 ℃ to r.t.; (13) CH3ONa, CH3OH/CH2Cl2, r.t..

1.2.1糖供體1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖(1)的合成參照文獻[22]方法合成糖供體1, 白色固體, 收率43%, m.p. 142～144 ℃(文獻值[22]: 143～144 ℃).

1.2.2中間體4a和4b的合成分別以化合物2a或2b為原料, 參照文獻[23]方法合成中間體4a和4b.

1.2.3中間體5a～9a和5b～9b的合成中間體3,6-二氧雜-8-(N-鄰苯二甲酰基)-辛基(2,3,4,6-四-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷(5a)的合成: 取化合物4a(1.88 g, 2.97 mmol)置于反應瓶中, 加入無水DMF溶解完全, 再加入鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(605 mg, 3.27 mmol), 所得反應液于110 ℃攪拌12 h, 冷卻至室溫后, 將其分散到乙酸乙酯和稀鹽酸(0.1 mol/L)中, 萃取, 將有機層用水洗滌至中性, 無水MgSO4干燥, 減壓蒸干溶劑, 殘留物經硅膠柱色譜純化, 得1.6 g淺黃色油狀化合物5a.

中間體N-Boc-8-氨基-3,6-二氧雜-辛基-(2,3,4,6-四-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷(8a)的合成: 取化合物5a(1.56 g, 2.57 mmol)置于反應瓶中, 加入100 mL甲醇溶解完全, 再加入21 mL水合肼(質量分數50%)和4 mL水后, 于80 ℃回流40 min, 所得反應液蒸干得2.1 g淺黃色塊狀化合物6a粗品. 將化合物6a粗品以50 mL無水乙醇和8 mL水完全溶解, 加入NaHCO3(1.08 g, 12.83 mmol)粉末, 冷卻至0 ℃, 緩慢滴加2.95 mL(Boc)2O(12.83 mmol)后, 繼續于0 ℃攪拌10 min, 再于室溫反應12 h, 所得反應液經過濾除去不溶物, 蒸干溶劑得5.3 g淺黃色油狀化合物7a粗品. 將化合物7a粗品用60 mL無水吡啶完全溶解, 冷卻至0 ℃, 緩慢加入30 mL醋酐后, 再于室溫反應12 h, 所得反應液用乙酸乙酯和稀鹽酸(0.1 mol/L)分散, 萃取, 有機層依次用鹽酸(5 mol/L, 100 mL×3)和水 (100 mL×4)洗滌, 無水MgSO4干燥, 減壓蒸干溶劑, 所得殘留物經硅膠柱色譜純化即得1.2 g無色油狀化合物8a.

中間體8-氨基-3,6-二氧雜-辛基-(2,3,4,6-四-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷(9a)[24]的合成: 將化合物8a用10 mL無水CH2Cl2完全溶解, 冰水浴冷卻至0 ℃, 緩慢滴加10 mL三氟乙酸, 自然升至室溫反應5 h后, 將反應液減壓蒸干, 再加入3 mL無水CH2Cl2稀釋, 緩慢滴加三乙胺調節pH至中性, 減壓蒸干溶劑, 得2.5 g淺黃色油狀化合物9a粗品, 該粗品未經純化直接用于下一步反應.

采用與中間體3a～9a相同的合成方法, 以三縮四乙二醇(2b)替換二縮三乙二醇(2a)為原料制得中間體3b～9b, 所得淺黃色油狀化合物9b粗品未經純化直接用于下一步反應.

1.2.4中間體13a～13c的合成中間體13a～13c參考文獻[8,9]方法合成.

1.2.5中間體14a～14c的合成以中間體14a的合成為例. 取化合物13a(450 mg, 1.04 mmol)和粗品化合物9a混合于反應瓶中, 加入30 mL無水CH2Cl2和0.22 mL NMM(1.98 mmol), 冷卻至0 ℃, 在氬氣保護下, 滴加含0.14 mL IBCF(1.09 mmol)的CH2Cl2溶液5 mL, 滴加完畢, 繼續攪拌反應10 h, 加少量水終止反應. 減壓蒸干溶劑, 殘留物用乙酸乙酯和水分散, 萃取, 有機層依次以酸水(0.1 mol/L)、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉洗滌, 無水MgSO4干燥, 減壓蒸干溶劑, 所得殘留物經硅膠柱色譜純化即得613.1 mg白色粉末狀化合物14a. 參照上述方法制得中間體14b～14f.

所有中間體的理化性質、質譜及核磁共振數據分別列于表1～表3.

Table 1　　　　Appearance, yields, melting points, specific rotation and ESI-MS data for all the intermediates*

* ---: No value or not measured.

Table 2　1H NMR data for intermediates 3 and 4*

*1H NMR for compounds 3a and 4a: 500 MHz, for compounds 3b and 4b: 400 MHz.

Table 3　1H NMR and 13C NMR data for intermediates 5, 8 and 14

Continued

Compd.1HNMR(400MHz,CDCl3),δ13CNMR(100MHz,CDCl3),δ14e7.98(s,1H),7.81(d,J=8.1Hz,1H),7.61(d,J=7.9Hz,1H),7.30—7.04(m,11H),6.92(d,J=7.8Hz,2H),6.49(t,J=5.0Hz,1H),5.38(d,J=3.3Hz,1H),5.20(dd,J=10.5,8.0Hz,1H),5.05(dd,J=10.5,3.4Hz,1H),4.91—4.82(m,1H),4.67—4.56(m,2H),4.20—4.07(m,2H),3.98—3.90(m,2H),3.77—3.69(m,1H),3.67—3.48(m,10H),3.48—3.29(m,4H),3.11(d,J=6.9Hz,2H),3.01(dd,J=6.9,1.5Hz,2H),2.12(s,3H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H)170.5,170.4,170.23,170.21,170.19,169.5,165.6,140.5,136.4,136.3,136.2,135.7,130.1,129.3,129.2,128.7,128.3,127.0,126.7,126.3,101.1,94.1,70.8,70.5,70.5,70.41,70.38,70.12,70.09,69.4,68.9,68.8,67.0,61.2,54.7,54.4,39.2,38.6,38.1,20.7,20.62,20.60,20.5814f7.63(d,J=8.7Hz,2H),7.39(d,J=8.7Hz,2H),7.19—7.06(m,7H),6.79(d,J=8.6Hz,2H),5.39(dd,J=3.4,1.0Hz,1H),5.22(dd,J=10.5,7.9Hz,1H),5.06(dd,J=10.5,3.4Hz,1H),4.83—4.76(m,1H),4.65—4.57(m,2H),4.20—4.09(m,2H),4.01—3.92(m,4H),3.78—3.70(m,1H),3.67—3.29(m,14H),3.07(dd,J=6.7,2.3Hz,2H),3.02(d,J=6.9Hz,2H),2.13(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),1.98(s,3H),1.38(t,J=7.0Hz,3H)170.7,170.6,170.39,170.36,170.3,169.7,166.2,158.2,138.2,136.6,132.2,130.4,129.4,128.9,128.7,128.68,128.1,127.0,114.8,101.4,71.0,70.8,70.7,70.6,70.6,70.3,70.3,69.6,69.1,68.9,67.2,63.5,61.4,55.0,54.6,39.3,38.6,37.4,20.9,20.80,20.78,20.7,15.0

1.2.6目標化合物15a～15f的合成參考文獻[25]方法合成目標化合物15a～15f.

目標化合物15a～15f的理化性質、質譜及核磁共振數據分別列于表4和表5. 核磁共振譜圖見圖S1～S12(見本文支持信息).

Table 4　　　　Appearance, yields, melting points, specific rotation, MS and IR data for the target compounds 15a—15f

a. Specific rotation solvent for compound 15a: CHCl3, for others: CH3OH;b. HRMS, compuond 15f: [M+H]+, others: [M+Na]+.

Table 5　1H NMR and 13C NMR data for the target compounds 15a—15f

Continued

Compd.1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ13CNMR(100MHz,DMSO-d6),δ15c1H),4.34(d,J=4.5Hz,1H),4.07(d,J=7.3Hz,1H),3.91(q,J=7.0Hz,2Ha),3.85—3.77(m,1H),3.62—3.58(m,1H),3.57—3.44(m,11H),3.39—3.10(m,4H),2.99—2.91(m,2H),2.82(dd,J=13.8,9.4Hz,2H),1.25(t,J=7.0Hz,3H)69.9,69.2,68.4,67.9,63.0,60.7,55.3,54.2,39.9,38.6,37.9,36.115d7.74(dd,J=8.7,5.4Hz,2H),7.30—7.08(m,12H),4.79(dd,J=9.4,5.7Hz,1H),4.60(t,J=7.3Hz,1H),4.24(d,J=7.5Hz,1H),4.02—3.95(m,1H),3.83—3.22(m,21H),3.21—3.05(m,2H),3.03—2.85(m,2H)173.3,173.1,169.0,167.5,165.0,138.6,138.2,131.5,131.2,131.1,130.4,130.3,129.5,129.4,127.8,116.4,116.2,105.1,76.7,74.9,72.5,71.6,71.5,71.3,70.4,70.3,69.6,62.5,56.6,56.0,40.4,39.2,38.415e8.01(s,1H),7.87(d,J=8.0Hz,1H),7.65(d,J=8.2Hz,1H),7.28—7.10(m,11H),4.79(dd,J=9.4,5.6Hz,1H,2-H),4.61(dd,J=8.1,6.3Hz,1H,),4.24(d,J=7.5Hz,1H),4.03—3.96(m,1H),3.85—3.23(m,21H),3.21—3.07(m,2H),3.01—2.87(m,2H)173.2,173.1,168.4,141.8,138.6,138.2,137.6,137.2,131.3,130.4,130.3,129.5,129.5,127.8,105.1,94.6,76.7,74.9,72.5,71.54,71.48,71.3,70.4,70.3,69.6,62.5,56.6,56.0,40.4,39.2,38.315f8.60(d,J=8.4Hz,1H),8.12(d,J=8.0Hz,1H),8.02(t,J=5.4Hz,1H),7.79(d,J=8.6Hz,2H),7.53(d,J=8.6Hz,2H),7.24—7.12(m,7H),6.77(d,J=8.6Hz,2H),4.83(d,J=4.4Hz,1H),4.70(d,J=5.0Hz,1H),4.66—4.45(m,3H),4.36(d,J=4.6Hz,1H),4.08(d,J=7.0Hz,1H),3.93(q,J=7.0Hz,2H),3.88—3.55(m,2H),3.59—3.10(m,20H),3.03—2.92(m,2H),2.90—2.79(m,2H),1.27(t,J=7.0Hz,3H)171.0,170.7,165.2,157.0,137.5,136.2,136.0,132.7,130.1,129.9,129.3,129.2,128.3,128.0,126.3,113.9,103.6,75.2,73.5,70.5,69.8,69.7,69.6,68.9,68.2,67.7,62.8,60.4,55.1,54.0,38.6,37.9,36.0,14.7

1.3目標化合物對HBV DNA抑制實驗

參照文獻[18]方法, 測試了目標化合物15a～15f對HepG2 2.2.15細胞HBV DNA復制抑制率.

2　結果與討論

2.1化合物的合成

在合成中間體5a時, 曾嘗試以對甲基苯磺酸二縮三乙二醇單酯為原料, 先與鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽反應, 再經糖基化反應得產物(合成路線2, 見Scheme 2). 但其第一步反應的產物與原料極性相近, 導致后續分離效果不佳, 且總收率僅為16%. 而當改變反應順序, 按照合成路線1(見Scheme 1), 先進行糖基化反應, 再進行取代反應, 所得產物與原料的極性差別較大, 易于分離純化, 且總收率為41%.

Scheme 2　Synthetic route 2 for intermediate 5a

在合成中間體8a～8b過程中, 曾嘗試采用甲胺法[26]和N2H4·H2O法[27]等選擇性脫除鄰苯二甲酰保護基的同時保留乙酰基, 但均未成功. 最后采取Scheme 1中所示的三步反應一鍋法完成, 總收率為58%.

2.2化合物氧苷鍵構型的確證

在糖基化過程中, 作為糖基化供體的全乙酰基半乳糖與對甲基苯磺酸二縮三乙二醇單酯(或對甲基苯磺酸三縮四乙二醇單酯)在三氟化硼乙醚作用下進行糖基化反應, 生成相應的糖苷, 條件溫和且收率較高; 并且由于2位乙酰基的鄰基參與效應而立體專一地生成了β-糖苷. 核磁共振氫譜中化合物4a和4b的半乳糖基1-H與2-H的偶合常數均為8.0 Hz, 故可判斷糖苷鍵的構型為β構型; 通過目標化合物半乳糖基端基碳C1的化學位移和氫譜中端基質子1-H與2-H的偶合常數再次確認所有目標化合物中糖苷鍵的構型均為β構型[28].

Table 6　　　　Inhibition ratios for the replication of HBV DNA of compounds 15a—15f*

* Lamivudine: an antiviral agent used as positive control.

2.3生物活性

目標化合物15a～15f的抗HBV活性測試結果(表6)表明, 所有目標化合物對HepG2 2.2.15細胞內HBV DNA的復制均有抑制作用, 且呈現出一定的量效關系. 其中, 化合物15b, 15c和15f體外抗HBV活性較好, 在藥物濃度為50 μg/mL時抑制率分別為72.24%, 56.49%和65.24%.

綜上所述, 以二縮三乙二醇或三縮四乙二醇為連接臂, 全乙酰化半乳糖為糖給體, 以L-苯丙氨醇甲酯鹽酸鹽、L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽、苯甲酸及其衍生物等為原料, 經縮合、水解、烷基化、糖基化及脫乙酰基等反應步驟, 設計合成了6個具有肝靶向潛力的MTS衍生物; 通過1H NMR,13C NMR,1H-1HCOSY, HMQC和ESI-ME等確認了其結構; 體外抗HBV活性測試結果表明, 所有目標化合物對HepG2 2.2.15細胞的HBV DNA的復制均有抑制作用, 并具有一定的量效關系. 通過與前期以乙醇胺為連接臂的肝靶向MTS衍生物進行活性比較發現, 連接臂長短對目標化合物的體外抗HBV活性無規律性影響, 但絕大部分目標化合物活性比直接糖基化目標化合物好.

感謝貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室張建新研究員測試并提供所有核磁共振數據.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160222.

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(Ed.: P, H, N, K)

Synthesis and Anti-HBV Activities of the Indirect Galactopyranosyl Derivatives of Matijin-Su?

XU Guangcan1,2, YUAN Jie1,4, LIU Qingchuan3, HUANG Zhengming3, LIANG Guangyi1,2*, XU Bixue1*

(1.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China;2.CollegeofPharmacy,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;3. 302HospitalofPLA,Beijing100039,China;4.HouBoCollegeofXinjiangMedicalUniversity,Karamay834000,China)

To explore the effect of the length of the linker on the activities of the derivatives of Matijin-Su(MTS) with potential for hepatic targeting, six galactosyl derivatives of MTS with potential for hepatic targeting were synthesized by binding galactosyl to derivatives of MTS using triethylene glycol or tetraethylene glycol as a linking arm, and their structures were confirmed by means of1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY, HMQC and ESI-MS. The anti-HBV activities of those compounds were evaluated using HepG2 2.2.15 cells. The screening results showed that all the target compounds had inhibitory effect on HBV DNA replication in HepG2 2.2.15 cells in a dose-response manner. The inhibition rates of compounds 15b(72.24%), 15c(56.49%), 15f(65.24%) on the replication of HBV DNA were better than other tested compounds, when the in concentration of the drug was 50 μg/mL. The results can provide reference for further research of hepatic targeting MTS derivatives. For the evaluation of the hepatic target distribution of galactopyranosyl derivatives of MTS, compound 15b with best anti HBV activity will be selected to do tissue distribution experimentsinvivoand comparative study with derivative of MTS(13b) and Y101.

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360472).

Hepatic targeting; Glacatose; Derivatives of Matijin-Su(MTS); Anti-hepatitis B virus activity

2016-05-20. 網絡出版日期: 2016-07-19.

國家自然科學基金(批準號: 81360472)資助.

O629

A

聯系人簡介: 梁光義, 男, 博士, 教授, 博士生導師, 主要從事天然產物化學方面的研究. E-mail: guangyi_liang@126.com

徐必學, 男, 博士, 副研究員, 主要從事藥物化學方面的研究. E-mail: bixue_xu@126.com