基于中性解吸-電噴霧萃取電離質譜直接檢測蜂蜜中的四環素

鄧　敏, 方小偉, 郭夏麗, 黃學勇, 劉星星,, 于騰輝, 羅麗萍

(1. 南昌大學生命科學學院, 南昌 330031; 2. 東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室, 南昌 330013)

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基于中性解吸-電噴霧萃取電離質譜直接檢測蜂蜜中的四環素

鄧敏1, 方小偉2, 郭夏麗1, 黃學勇1, 劉星星1,2, 于騰輝1, 羅麗萍1

(1. 南昌大學生命科學學院, 南昌 330031; 2. 東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室, 南昌 330013)

基于中性解吸-電噴霧萃取電離質譜(ND-EESI-MS)建立了無需樣品預處理即可直接檢測蜂蜜中四環素的方法. 測定結果表明, 加標蜂蜜四環素樣品在20～1000 ng/mL濃度范圍內線性關系良好(R2>0.997), 檢出限為1.08 ng/mL; 加標濃度為50, 500和1000 ng/mL蜂蜜樣品的回收率分別為94.26%, 98.38%和103.00%, 精密度(RSD)分別為3.28%, 1.39%和1.12%. 應用此方法對8種市售蜂蜜進行檢測, 發現2種蜂蜜中含有痕量的四環素, 其余蜂蜜均未檢出, 而應用高效液相色法在這8種市售蜂蜜中均未檢出四環素. 本方法無需經過復雜的樣品預處理, 靈敏度高、精密度好、分析速度快且特異性強, 能夠承受蜂蜜中復雜基體的影響, 是一種快速檢測蜂蜜中四環素的方法.

中性解吸-電噴霧萃取電離; 質譜; 四環素; 蜂蜜; 直接檢測

四環素(Tetracycline, TC)是由鏈霉菌產生的一種廣譜抗生素, 為四環素類抗生素(TCs)中的一種, TCs主要還包括土霉素(Oxytetracycline, OTC)、金霉素(Chlort-etracycline, CTC)等[1]. 由于其廣譜的抗菌作用和低廉的價格, 現已被廣泛應用于動物性疾病的防治[2]. 養蜂生產中, 蜂農常用抗生素防治蜜蜂病蟲害以及蜜蜂采集了農作物上攜帶藥物殘留的花粉和花蜜, 都易造成蜂產品中抗生素的殘留[3]. 長期大量使用TCs可損害肝臟, 造成肝腫大、變性及壞死等, 也有可能引起腎功能衰竭[4]. 鑒于TCs殘留的危害, 一些國家對蜂蜜中TC殘留設定了最大殘留限量值(Maximum residue limit, MRL), 另一些國家禁止對蜜蜂使用四環素類抗生素, 中國對蜂蜜中TC殘留的MRL值要求為50 ng/g[5].

目前, 檢測蜂產品中TCs殘留的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)和酶聯免疫分析(ELISA)等. Fujita等[6]將樣品經Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取后, 過柱凈化富集, 進行高效液相色譜-熒光(HPLC-FLD)檢測, TC的檢出限(LOD)為0.70 ng/g; Peres等[7]將樣品經單固相萃取, C8色譜柱分離, 應用HPLC-FLD檢測蜂蜜中TC的LOD為8.00 mg/kg; 葉有標等[8]建立了LC-MS測定蜂王漿中TC殘留的方法, 樣品經提取、過柱凈化, 然后采用LC-MS進行測定, 該方法對蜂王漿中TCs的LOD為10.00 ng/g; 曹慧等[9]采用多壁碳納米管固相萃取-UPLC-MS/MS串聯質譜技術同時測定蜂蜜中的磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類和四環素類等52種獸藥殘留, 定量限為1.50～7.50 mg/kg. Chen等[10]應用ELISA法檢測蜂蜜中的TC, 其動態檢測范圍為0.26～2.00 μg/L, IC50值為0.72 μg/L; Wang等[11]應用ELISA方法測得蜂蜜中TC的LOD為0.0096 μg/L. 總體來看, 這些方法需要對樣品進行提取、凈化和富集處理, 可能存在分析時間長、操作復雜、背景干擾及樣品凈化不完全等不足, 難以實現對蜂蜜中TC的快速檢測.

中性解吸-電噴霧萃取電離質譜(Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry, ND-EESI-MS)技術是一種適用于復雜基體分析的方法, 已被廣泛地用于分析各種形態的復雜基體樣品, 在蜂蜜、奶酪、牙膏以及化妝品等黏性樣品檢測上有良好效果. Liu等[12]和Zhang等[13]采用ND-EESI-MS對黏性化妝品中的磺胺類藥物、激素和非法防曬劑等進行了檢測, 該方法的檢測范圍為0.001～1.00 ng/g.

本文采用ND-EESI-MS技術, 無需樣品預處理即可直接檢測蜂蜜中的TC殘留. 為蜂蜜中TC殘留的檢測提供了一種直接、快速的方法, 也為其它復雜食品體系中農藥化學殘留的檢測提供了參考.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

TC標準品(純度98.8%, 阿拉丁試劑公司); 乙醇、乙酸乙酯和乙腈(色譜純, 迪馬科技有限公司); 甲醇(色譜純, 美國TEDIA公司); 乙酸(色譜純, 如意科技有限公司); 無水磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮、甲酸和草酸均為國產分析純; 洋槐蜂蜜由江西農業大學蜜蜂研究所提供.

中性解吸裝置和EESI離子源(江西省質譜科學與儀器重點實驗室研制); LTQ-XL線性離子阱質譜儀(美國Finnigan公司), 配有Xcali-bur數據處理系統; Agilent 1200型高效液相色譜儀(配有DAD檢測器, 美國Agilent科技公司); SPE固相萃取儀(月旭科技公司); DSC-18Lt固相萃取小柱(美國Supelco公司); 精密電子天平(Mettler Toledo公司); 純水制備儀(美國Thermo Fisher公司).

1.2ND-EESI-MS檢測

1.2.1溶液的制備TC標準溶液的配制: 取適量TC標準品, 用超純水配制成100 μg/mL的TC儲備液, 于4 ℃冷藏保存; 用超純水稀釋儲備液, 得到相應濃度的TC標準溶液, 現配現用.

加標蜂蜜的配制: 參照文獻[14]方法, 經多次稱量計算蜂蜜密度為1.44 g/mL, 分別稱取27.30 g(19.00 mL)蜂蜜(精確至0.01 g)置于50 mL錐形瓶中, 用保鮮膜封口, 于60 ℃水浴5 min, 加入1 mL一定濃度的TC標準溶液于錐形瓶中, 制成加標蜂蜜, 冷卻至室溫, 待測.

Fig.1　　　　ND-EESI-MS experimental device for TC detection in spiked honey

1.2.2ND-EESI-MS條件對ND-EESI-MS的實驗條件進行了初始優化, 設定EESI離子源[12]樣品通道口與質譜口水平夾角β保持150°, 2條噴霧通道夾角α保持60°, 2條噴霧通道口與質譜口距離為0.50 cm(圖1); 采用正離子檢測模式, 質量范圍m/z50～600; 進行CID(Collision-induced Dissociation)實驗時, 母離子隔離寬度1.1, 碰撞能量25%. 中性解吸劑和萃取劑為甲醇, 電噴霧電壓為3.5 kV, 流速為4 μL/min, 霧化氣(氮氣, 純度99.999%)壓力為1.2 MPa, 樣品輔助端氣壓(氮氣)為1.2 MPa, 離子傳輸管溫度為150 ℃, 其它條件由系統自動優化[14,15].

1.3HPLC檢測

1.3.1溶液的配制Mcllvaine緩沖溶液的配制: 將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合, 必要時用氫氧化鈉或鹽酸溶液調節pH=4.0±0.05.

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制. 稱取60.50 g Na2EDTA加入1625 mL Mcllvaine緩沖溶液中, 使其溶解, 搖勻, 得到0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液.

1.3.2蜂蜜中TC的提取和凈化準確稱取5.00 g蜂蜜置于50 mL的離心管中, 加入15 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液, 混勻, 靜置, 以3500 r/min轉速于10 ℃離心15 min, 將上層清液轉移到另一個50 mL離心管中, 待凈化. 將DSC-18Lt凈化柱依次用乙腈、10 mmol/L草酸(pH=3.0)各5 mL活化, 然后用5 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液過柱. 將提取樣液上柱, 待液體全部流出后用3 mL 10 mmol/L草酸(pH=3.0)淋洗, 用3 mL流動相[V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(10 mmol/L草酸溶液)=2∶1∶7]洗脫, 用10 mL離心管收集洗脫液, 過0.45 mm濾膜, 供HPLC檢測[7].

HPLC條件: C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 mm); 流動相:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(10 mmol/L草酸溶液)=2∶1∶7, 現配現用; 流速1.00 mL/min; 紫外檢測器波長350 nm; 進樣量20 mL; 柱溫25 ℃.

2　結果與討論

2.1加標蜂蜜的ND-EESI-MSnTC定性分析

在正離子模式下, 對TC(Mw=444,m/z445)標準品溶液(500 ng/mL)進行EESI-MSn掃描[16]. 在TC的二級質譜圖(圖2)中, 獲得了目標質譜峰m/z427, 428和410, 可分別歸屬為[M+H-H2O]+, [M+H-NH3]+和[M+H-H2O-NH3]+[17～20]. 在相同條件下, 分別對未加標和加標蜂蜜(500 ng/mL)進行ND-EESI-MSn掃描, 并與EESI-MSn進行對照分析. 結果表明, 加標蜂蜜中TC的ND-EESI-MS2譜圖中存在m/z427和428碎片離子峰, 與TC標準品溶液EESI-MS2的碎片相同, 可選用豐度較高的m/z427碎片離子作為TC的定量離子.

Fig.2　　　　EESI-MS2(A) and ND-EESI-MS2(B) spectra of tetracycline(A) TC standard solution(500 ng/mL); (B) the spiked honey sample(500 ng/mL).

2.2ND-EESI-MS實驗條件的優化

選擇TC 的m/z445二級豐度高的特征離子m/z427進行定量分析. 以加標蜂蜜(500 ng/mL)為檢測對象, 以m/z427凈響應信號平均值為指標, 對萃取劑、中性解吸劑、電噴霧電壓、離子傳輸管溫度和萃取劑流速等實驗參數進行了優化.

2.2.1萃取劑的優化分別以甲醇、乙醇、水、甲醇/水、乙醇/水、丙酮、乙腈和乙酸乙酯作為萃取劑, 進行優化實驗. 結果表明, 以水、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇/水、甲醇和乙醇作為萃取劑時, 定量離子m/z427的信號強度為0～5.79; 以乙醇/水作為萃取劑時m/z427的信號強度為13.28. 加酸可以提高樣品質子化效率, 故分別向乙醇/水中加入不同體積分數(1%, 5%, 10%, 15%和20%)的甲酸和乙酸作為萃取劑. 結果表明, 隨著乙酸濃度的增大,m/z427信號強度先減小后增大, 在乙酸濃度為20%時達到最高, 為18.93; 而甲酸濃度無論大小,m/z427信號強度都為0. 因此選擇20%乙酸的乙醇/水作為萃取劑.

2.2.2中性解吸劑的優化采用最佳萃取劑, 以甲醇、乙醇、水、甲醇/水及乙醇/水作為中性解吸劑進行優化實驗, 結果表明, 以甲醇/水為解吸劑時,m/z427信號強度較高; 進一步對不同配比的甲醇/水(體積比為0∶10, 1∶9, 3∶7, 5∶5, 7∶3, 9∶1和10∶0)進行解吸劑優化, 結果表明, 當以甲醇/水(體積比9∶1)為解吸劑時,m/z427信號強度最高, 為40.98. 因此, 選用甲醇/水(體積比9∶1)為解吸劑.

2.2.3其它參數的優化采用最佳萃取劑和解吸劑, 分別對電噴霧電壓、離子傳輸管溫度及萃取劑流速等參數進行了優化. 結果表明, 在各個參數下m/z427信號強度均先增大后減小. 經優化獲得的最佳參數: 電噴霧電壓3.5 kV, 離子傳輸管溫度200 ℃, 萃取劑流速4 μL/min.

2.3ND-EESI-MS檢測的標準曲線和檢出限

Fig.3　　　　Calibration curve of tetracycline in spiked honey

2.3.1標準曲線和檢出限按1.2.1節加標蜂蜜的配制方法配制10～1000 ng/mL系列梯度濃度的加標蜂蜜四環素溶液, 在最優條件下進行ND-EESI-MSn檢測, 每個濃度的加標蜂蜜平行測定6次, 以加標蜂蜜TC的濃度為橫坐標,m/z427凈響應信號平均值為縱坐標繪制標準曲線(圖3). 結果表明, 加標蜂蜜TC濃度在20～1000 ng/mL范圍內線性關系良好, 線性方程為y=0.0908x+6.2204[y為m/z427信號強度,x為TC濃度(ng/mL)], 相關系數R2=0.997, 檢出限為1.08 ng/mL.

2.3.2回收率和精密度在20～1000 ng/mL范圍內分別添加50, 500和1000 ng/mL 3個濃度的加標蜂蜜四環素溶液, 按優化后的ND-EESI-MS實驗方法進行回收率實驗, 每個濃度的加標蜂蜜平行測定6次, 得到加標回收率分別為94.26%, 98.38%和103.00%, 精密度(RSD)分別為3.28%, 1.39%和1.12%.

2.4HPLC檢測結果

配制20～1000 ng/mL系列梯度濃度的加標蜂蜜四環素溶液, 經提取和凈化后進行HPLC檢測, 每個濃度的加標蜂蜜平行測定5次, 以加標蜂蜜四環素的濃度為橫坐標, 峰面積平均值為縱坐標繪制工作曲線. 結果表明, 加標蜂蜜四環素在50～1000 ng/mL范圍內線性關系良好, 線性方程為y=0.0114x+0.8983[y為峰面積;x為四環素濃度(ng/mL)], 相關系數R2=0.999, 檢出限為3.46 ng/mL. 在 50～1000 ng/mL范圍內添加50, 500和1000 ng/mL 3個濃度的加標蜂蜜四環素溶液, 按相同方法進行回收率實驗, 得到加標回收率分別為105.56%, 96.51%和97.38%, 精密度(RSD)分別為2.31%, 1.44%和0.65%. 分別用ND-EESI-MS和HPLC檢測蜂蜜中的四環素都獲得了較好的回收率和精密度, 但ND-EESI-MS的檢出限和線性范圍略好于HPLC.

Table 1　Comparison of tetracycline detection in spiked honey samples using ND-EESI-MS and HPLC

2.5ND-EESI-MS和HPLC檢測市售蜂蜜中四環素殘留

分別采用ND-EESI-MS和HPLC法對購自南昌當地超市的苜蓿蜜、百花蜜、槐花蜜、棗花蜜、芙蓉蜜、油菜蜜、紫云英蜜和雜花蜜等蜂蜜樣品中的四環素進行檢測. ND-EESI-MS檢測結果顯示, 除油菜蜜和雜花蜜檢出痕量四環素外, 其余蜂蜜中均未檢出; 采用HPLC法在8種市售蜂蜜中均未檢出四環素.

綜上所述, 建立了蜂蜜中四環素殘留的ND-EESI-MS檢測方法, 對蜂蜜中四環素的檢出限為1.08 ng/mL, 回收率94.26%～103.00%, 精密度≥3.28%; 采用ND-EESI-MS和HPLC檢測蜂蜜中的四環素都有較好的回收率和精密度, ND-EESI-MS的檢出限和線性范圍略優于HPLC; 采用ND-EESI-MS從8種市售蜂蜜樣品中的油菜蜜和雜花蜜中檢出了痕量四環素, 而HPLC均未檢出. ND-EESI-MS無需樣品預處理, 在常溫常壓下即可直接檢測蜂蜜中殘留的四環素. 本方法為實現直接、快速、原位檢測蜂蜜中四環素殘留提供了一條新途徑, 也為其它復雜食品體系中農藥化學殘留的檢測提供了參考.

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(Ed.: N, K)

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Direct Detection of Tetracycline in Honey by Neutral Desorption-Extractive Electrospray Ionization Mass Spectrometry?

DENG Min1, FANG Xiaowei2, GUO Xiali1, HUANG Xueyong1,LIU Xingxing1,2, YU Tenghui1, LUO Liping1*

(1.SchoolofLifeSciences,NanchangUniversity,Nanchang330031,China; 2.JiangxiKeyLaboratoryforMassSpectrometryandInstrumentation,EastChinaUniversityofTechnology,Nanchang330013,China)

A novel platform of neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry(ND-EESI-MS) for direct and rapid detection oftetracycline(TC) in honey sample without any sample pretreatment wa constructed. The results showed that the limit of detection was 1.08 ng/mL with a linear working range from 20 to 1000 ng/mL(R2>0.997) toward TC in honey; the recoveries and relative standard deviations of TC from spiked samples, at three fortification levels(50, 500, 1000 ng/mL), were 94.26%, 98.38%, 103.00% and 3.28%, 1.39%, 1.12%, respectively. Eight common commodity honey samples were detected by this method and the results reveal that 2 of them contain traces of TC, while TC is not found in the rest samples. HPLC was also applied for TC detection in the asme honey samples, and TC is not found. Therefore, this ND-EESI-MS method is sensitive, rapid and specific for quantitative analysis of TC in honey without any sample pretreatment.

Neutral desorption-extractive electrospray ionization; Mass spectrometry; Tetracycline; Honey; Direct analysis

2016-03-03. 網絡出版日期: 2016-07-11.

“十二五”國家科技計劃課題(批準號: 2012BDA29B01)、國家自然科學基金(批準號: 31071551)、長江學者和創新團隊發展計劃項目(批準號: IRT13054)和江西省科技廳項目(批準號: 20121BDH80020)資助.

O652.1

A

聯系人簡介: 羅麗萍, 女, 博士, 教授, 博士生導師, 主要從事植物學新技術、新方法和植物次生代謝產物方面的研究.

E-mail: lluo2@126.com