東莞漢族人血清PCSK9水平與冠心病關系的研究

鐘孟如，劉忠民，萬德勝，李偉其，莫玉前 （廣東省東莞市人民醫院檢驗科，廣東東莞523059）

·基礎與轉化醫學·

東莞漢族人血清PCSK9水平與冠心病關系的研究

鐘孟如，劉忠民，萬德勝，李偉其，莫玉前 （廣東省東莞市人民醫院檢驗科，廣東東莞523059）

【摘 要】目的：探討廣東東莞地區漢族人前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9（PCSK9）的血清學水平及其與冠心病的相關性.

方法：選取廣東省東莞市人民醫院2014-06/2015-06經冠脈造影確診的60例冠心病患者的血清標本和60例非冠心病對照組的血清標本，用ELISA測定血清PCSK9水平，用酶法測定血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的濃度水平.結果：冠心病組的血清PCSK9水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01），冠心病組的CHOL、TG、LDL水平均高于非冠心病組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C的相關系數是0.458，0.460，0.429（P＜0.05）；冠心病組的女性PCSK9水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），冠心病組在＜60歲的年齡階段PCSK9水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）.結論：PCSK9水平可作為預測冠心病的一個血清學指標，且PCKS9水平與血脂水平、年齡、性別密切相關.

【關鍵詞】PCSK9水平；冠心病；血脂水平；年齡；性別

0　引言

流行病學調查顯示，血脂水平異常是造成冠心病（coronary heart disease，CHD）死亡率及催患率增加的主要因素.前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subti1isin/kexin type 9，PCSK9）基因是除LDLR和ApoB100之外，第三個與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關的基因. PCSK9 cDNA的大小為3617bp，編碼692個氨基酸組成的PCSK9蛋白，主要在肝臟、腸道表達，少量表達于腎臟、皮膚、腦中［1］.PCSK9通過結合于低密度脂蛋白受體（LDL receptor，LDLR）的表皮生長因子（epiderma1 growth factor，EGF）樣結構域，與LDLR共同內化，抑制LDLR的釋放與返回細胞膜，誘導LDLR進入溶酶體內降解，細胞表面LDLR數量的減少將導致血漿低密度脂蛋白膽固醇（1ow?density1ipoprotein cho1estero1，LDL?C）的水平升高［2］.PCSK9的突變基因于2003年首次被報道［3］，其突變分為功能獲得型和功能缺失型，功能獲得型突變可增強PCSK9上調LDL?C的能力［4］，功能缺失型則相反.本實驗擬探討血清PCSK9水平與血脂水平、CHD之間的關聯性，為CHD的個性化治療、療效判斷等提供依據.

1　資料和方法

1.1一般資料 選取廣東省東莞市人民醫院心血管內科2014-06/2015-06經冠脈造影確診的60例CHD患者的血清標本和60例非CHD對照組的血清標本，CHD患者中男45例，女15例，年齡（65.13± 14.63）歲；非 CHD患者中男39例，女21例，年齡（49.03±16.91）歲.

1.2納入標準 廣東東莞漢族人，CHD患者有胸痛癥狀，心電圖ST?T改變，冠脈造影顯示左主干、左前降支、左回旋支及右冠狀動脈中，至少有一支血管狹窄≥50%.健康人群經詢問病史、體檢及心電圖、胸部X線射片等檢查，排除心血管疾病歷史，未發現血脂、肝功能異常，年齡、性別與CHD患者組相近.

1.3排除標準 組內及組間個體有血緣關系者；有糖尿病、肝腎疾病以及其他內分泌異常疾病者；健康對照組檢查發現有心血管疾病者及其他不合適者.

1.4主要試劑與儀器 試劑：PCSK9 ELISA試劑盒（R&D Systems，Inc），EB（捷倍思），血脂試劑（貝克曼公司）.儀器：離心機（Eppendorf公司），酶標儀（Bio?TekELX800），微量可調移液器（Eppendorf公司）；貝克曼全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）.

1.5方法

1.5.1冠狀動脈造影及病變程度評估 采用Judkin's法，用6F左右造影管以Se1dinger技術穿刺右股動脈途徑進行造影.應用Gensini積分法［5］對入選病例的冠脈造影結果進行評分：無狹窄，0分；狹窄≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分.不同的血管病變部位有對應的系數：左主干，×5；前降支近段，回旋支近段，×2.5；前降支中段，×1.5；回旋支開口處，×3.5；前降支第一對角支、第二對角支、心尖部，回旋支的鈍緣支、遠段，右冠狀動脈近段、中段、遠段，后降支，×1；左室后側支，×0.5.用血管狹窄程度評分乘以病變部位對應的系數，每位患者的最終積分為各分支積分之和.

1.5.2標本采集 采集CHD組與對照組的空腹外周靜脈血，3000 r/min離心10 min分離收集血清1000 μL于EP管，于-80℃保存.CHD組于入院第一次生化檢測當天收集標本，健康人群血液標本于體檢當天收集.

1.5.3生化指標測定 收集樣本當天完成肝腎功能、血脂等項目測定.血清總膽固醇（tota1 cho1estero1，TC）、血清甘油三酯（trig1yceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density 1ipoprotein cho1estero1，HDL?C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）均采用酶法檢測.

1.5.4ELISA法檢測血清中PCSK9水平 Ca1ibrator Di1uent RD5P與去離子水1∶5配 Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液；Human PCSK9 standard干粉加2.0 mL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液，配成40 ng/mL的Human PCSK9 standard標準液；加100 uL的Di1uent RD 1-9到每個反應孔；標準液用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液做倍比稀釋，得到濃度為0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40 ng/mL的標準液；血清標本用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液稀釋20倍；將50 μL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液、各濃度的標準液、血清標本加到反應孔，Ca1ibrator Di1uent RD5P稀釋液、各濃度的標準液每板各加樣兩孔，標準品濃度從低到高；室溫靜置避光2 h后用Wash buffer洗滌四次；加200 μL的Human PCSK9 Conjugate到每個孔；室溫避光靜置 2 h后，Wash buffer洗滌四次；將 Co1or reagents A與Co1or reagents B混合配制成 Substrate so1ution，15 min內將200 μL的Substrate so1ution加到每個孔，避光孵育30 min；加50 μL的終止液 Stop so1ution，混勻后，30 min內酶標儀450 nm讀取數據，分別用兩板的標準曲線算出血清標本的濃度（圖1、2）.

圖1　第一板的血清PCSK9標準曲線1

圖2　第二板的血清PCSK9標準曲線2

1.5.5他汀藥物治療CHD前后PCSK水平比較 檢測他汀類藥物治療后3個月的CHD患者血脂水平，并與治療前的血脂水平進行比較.

1.6統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，不同指標間的相關性分析采用Pearson分析法，P＜0.05表示差異具有統計學意義.

2　結果

2.1兩組的PCSK9、血脂水平比較 CHD組的血清PCSK9水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；CHD組的TCH、TG、LDL?C均顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）.

表1　兩組的PCSK9水平、血脂水平比較（n=60，±s）

表1　兩組的PCSK9水平、血脂水平比較（n=60，±s）

aP＜0.05 vs對照組；bP＜0.01 vs對照組.

組別　PCSK9（ng/mL）　TCH（mmo1/L）　TG（mmo1/L）　HDL?C（mmo1/L）　LDL?C（mmo1/L）對照組　305.59±68.86　4.18±0.63　1.11±0.31　1.72±0.22　2.82±0.55 CHD組　359.96±102.28b　4.83±1.32a　1.45±0.61a　1.10±0.28　3.38±1.12a

2.2PCSK9水平與血脂水平相關性分析 對照組與CHD組的 120例標本，PCSK9水平（424.88± 100.94 ng/mL）與 TCH（4.34±1.33 mmo1/L）、TG （1.24±0.54 mmo1/L）、LDL?C（2.99±1.05 mmo1/L）的相關系數分別是0.458、0.460、0.140、0.429，說明血清PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C線性相關（表2）.

表2　PCSK9水平與血脂水平相關性分析

2.3CHD組的Gensini積分與PCSK9水平的相關性 將CHD患者根據Gensini積分分為三組，輕度組＜25分，中度組25～49分，重度組≥50分，僅輕度組的PCSK9水平與Gensini積分線性相關（r=0.647，P＜0.05，表3）.

表3　PCSK9水平與血脂水平相關性分析

2.4不同性別、年齡的PCSK血清學水平比較 統計發現男性與女性在組內比較，以及不同年齡階段的組內比較，PCSK血清學水平均無統計學意義（P＞0.05）；男性與女性分別進行組間比較，女性間有顯著差異［對照組（49.54±16.84）歲，CHD組（68.26± 11.85）歲，P＜0.05］；不同年齡段進行組間比較，在＜60歲年齡段差異有統計學意義（P＜0.05，表4）.

表4　不同性別、年齡間的PCSK血清學水平比較

3　討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱CHD，是一種多因素、多基因性疾病，具有遺傳易感性［6］，血脂水平異常是造成CHD死亡率及催患率增加的主要因素.血清中60%～70%的膽固醇通過低密度脂蛋白運輸［7］，LDL?C主要通過肝細胞表面的LDLR清除，LDL?C增高是動脈粥樣硬化的一個主要危險因子.

他汀類藥物是目前臨床上應用最廣泛的降脂藥物，其機制為抑制肝臟膽固醇合成過程中的限速酶3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG?CoA還原酶）的活性.在高膽固醇血癥患者中，他汀類藥物應用到最大允許劑量時可使LDL?C降低50%～60%［8］.但仍有約5%～10%的患者，盡管同時通過飲食和醫療，LDL?C仍在70 mg/dL的目標以上，且他汀類藥物劑量加倍，LDL?C水平只能再降低6%.產生這種現象的因素有多方面，細胞實驗發現，在使用西立伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀等處理人肝癌細胞HepG2及人原代肝細胞后，PCSK9呈濃度依賴性表達上調，其機制考慮為LDLR啟動區及PCSK9啟動區的SRE?1均能與低膽固醇激活的SREBP?2結合，激活轉錄機制使LDLR、PCSK9的數量均增加，因此影響了他汀藥類物降低LDL?C的作用.因此，當使用他汀類藥物治療后，出現血清學PCKS9水平持續升高時，應當考慮更換患者降脂的首選藥，或他汀類藥物與其他降脂藥的聯合使用.他汀類藥物的副作用主要是肌痛和肝酶升高，美國國家脂質協會的一項調查發現，約12%的患者會中止他汀治療，其中62%的患者是出于副作用的原因.因此，不能耐受他汀類藥物治療的患者可考慮使用無此副作用的PCKS9抑制劑［9］.賽諾菲Pra1uent及安進的Repatha均將上市，有可能成為未來降脂藥物的熱點.

PCSK9的基因突變分為功能獲得型和功能缺失型，功能獲得型突變導致嚴重的高膽固醇血癥和早發型CHD，增加心腦血管事件的發生率，功能缺失型則相反.研究發現，PCSK9基因變異均存在種族與性別的差異［10-12］，故PCSK9血清學水平存在個體化差異，該差異的存在對CHD的診斷、治療及預后觀察具有一定的價值.

研究結果顯示，CHD組的血清PCSK9水平顯著高于對照組（P＜0.01），提示PCSK9可作為預測CHD的一個血清學指標.同時，血清PCSK9水平與TCH、TG、LDL?C線性相關，當血脂水平高時，提示進行PCSK9水平檢測，可輔助CHD的診斷［13］.在Gensini積分的輕、中、重三組中，PCSK9均值水平雖然隨著Gensini積分的增加而上升，但僅與輕度組線性相關（P＜0.05），其機制尚未可知.CHD組的女性PCSK9水平顯著高于對照組，該現象考慮與女性的絕經期有關［14］，現已證明體內雌激素是重要的血管保護因子，可使女性的CHD較男性晚發生10年［15］，但Lakoski等［16］認為雌激素水平與PCSK9在絕經前的表達差異無關，而Persson等［17］的研究卻表明雌激素可以降低血漿中的PCSK9水平，因此雌激素是否影響PCSK9尚需進一步研究.CHD組間的PCSK9血清學水平在＜60歲的年齡段顯著高于對照組，而≥60歲后無此現象，考慮到CHD是一種多因素、多基因性的疾病，高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙和肥胖以及一些不良的生活習慣［18］均是其主要致病因素，故該現象可能是PCSK9基因突變導致的CHD發病年齡較非遺傳因素早所致.

由于CHD組三個月內因CHD復發入院的患者僅有2例，無法通過統計學比較PCSK9血清學水平對他汀類藥物藥物療效的影響，故需要延長數據收集時間，得到較大容量的樣本后再進行比較.

【參考文獻】

［1］Constantinides A，Kappe11e PJ，Lambert G，et a1.P1asma 1ipoprotein?associated phospho1ipase A2 is inverse1y corre1ated with proprotein convertase subti1isin?kexin type 9［J］.Arch Med Res，2012，43（1）：11-14.

［2］肖文虎，張 紅，彭湘萍，等.PCSK9結構與功能［J］.中國生物化學與分子生物學報，2009，25（3）：213-218.

［3］Seidah NG.PCKS9 as a therapeutic target of dys1ipidemia［J］.Expert Opin Ther Targets，2009，13（1）：19-28.

［4］A1born WE，Cao G，Careskey HE，et a1.Serum proprotein convertase subti1isin kexin type 9 is corre1ated direct1y with serum LDL cho1estero1［J］.C1in Chem，2007，53（10）：1814-1819.

［5］高 靈，孟照輝.冠狀動脈評分方法的研究進展［J］.醫學綜述，2013，19（9）：1601-1603，1609.

［6］Tiret L.Gene?environment interaction：a centra1 concept in mu1tifac?toria1 diseases［J］.Proc Nutr Soc，2002，61（4）：457-463.

［7］Tibo11a G，Norata GD，Arta1i R，et a1.Proprotein convertase subti1i?sin/kexin type 9（PCSK9）：from structure?function re1ation to thera?peutic inhibiton［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2011，21（11）：835-843.

［8］吳娜瓊.2011美國國家脂質協會成人家族性高膽固醇血癥患者管理建議解讀［J］.中國醫學前沿雜志：電子版，2012，4（2）：48-54.

［9］沈 莉，趙水平.降脂新藥PCSK9抑制劑研究現狀［J］.中華內科雜志，2013，52（7）：607-608.

［10］楊家大，漆小鳳，司小剛，等.江西地區畬族人群pcsk9基因變異的SNaPshot分析［J］.醫學分子生物學雜志.2011，8（3）：235-239.

［11］高 宇，王春梅，黃志亮，等.蒙古族人PCSK9基因E670G多態性與冠心病相關性研究［J］.中國醫藥導報，2015，12（10）：18-22.

［12］孟艷輝，劉忠民.廣東漢族人PCSK9基因E670G位點多態性與冠心病相關性研究［J］.熱帶醫學雜志，2011，11（2）：137-140.

［13］Dubuc G，Chamber1and A，Wassef H，et a1.Statins upregu1ate PCSK9，the gene encoding the proprotein convertase neura1 apoptosis?regu1ated convertase?1 imp1icated in fami1ia1 hypercho1estero1emia［J］. Arteriosc1er Thromb Vasc Bio1，2004，24（8）：1454-1459.

［14］郭 雯，付真真，崔 琴，等.前蛋白轉化酶枯草溶菌素9在絕經前后女性中的差異［J］.中華內分泌代謝雜志，2013，29（1）：46-49.

［15］馬會利，胡桃紅，鄒建宏，等.國人男女冠心病發病危險因素分析［J］.心血管康復醫學雜志，2011，20（6）：517-519.

［16］Lakoski SG，Lagace TA，Cohen JC，et a1.Genetic and metabo1ic determinants of p1asma PCSK9 1eve1s［J］.J C1in Endocrino1 Metab，2009，94（7）：2537-2543.

［17］Persson L，Henriksson P，Wester1und E，et a1.Endognous estrogens 1ower p1asma PCSK9 and LDL cho1estero1 but not Lp（a）or bi1e acid synthesis in women［J］.Arteriosc1er Thromb Vasc Bio1，2012，32（3）：810-814.

［18］俞閱彥，江時森，宋宏賓，等.不同性別冠心病危險因素與冠脈病變程度的相關性［J］.心臟雜志，2012，24（2）：205-208，218.

【中圖分類號】R541.4

【文獻標識碼】A

文章編號：2095?6894（2016）06?06?04

收稿日期：2016-05-07；接受日期：2016-05-21

基金項目：東莞市科技計劃醫療衛生類科研一般項目（2014105101170）

作者簡介：鐘孟如.E?mai1：X024050@163.com

Study on the assosiation betWeen the level of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han people in Dongguan

ZHONG Meng?Ru，LIU Zhong?Min，WAN De?Sheng，LI Wei?Qi，MO Yu?Qian
Laboratory Medicine，Peop1e's Hospita1 of Dongguan，Dongguan 523059，China

【Abstract】AIM：To investigate the assosiation between the 1eve1 of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han peop1e in Dongguan.METHODS：The serum samp1es of 60 patients with CHD and 60 peop1e without CHD（the contro1 group）admitted into Peop1e's Hospita1 of Dongguan from June 2014 to June 2015 were se1ected as objects of study.The serum PCSK9 1eve1 was measured by ELISA.The 1eve1s of TC、TG、HDL?C and LDL?C were measured by enzyme chemistry method.RESULTS：The 1eve1 of PCSK9 in CHD patients was higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.01）. The 1eve1s of TCH，TG and LDL?C in CHD patients were higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）；The corre1ation coefficient of PCSK9 and 1ipid 1eve1s in CHD patients were 0.458，0.460，0.429 respective1y （P＜0.05）；The serum PCSK9 1eve1 of fema1e in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.The serum PCSK9 1eve1 of the patients，who were younger than 60 years o1d in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.CONCLUSION：The p1asma PCSK9 1eve1s can be used as a new serum marker of coronary heart disease，and the 1eve1 of PCSK9 is c1ose1y corre1ated with 1ipid 1eve1s，age and gender.

【KeyWords】p1asma PCSK9 1eve1s；coronary heart disease；1ipid 1eve1；age；gender.