微量熱法研究黃芪多糖對大腸桿菌的抑制功能及機理

任　歷, 廖曉宇, 劉　鵬, 代春美

(1. 遼寧醫學院 基礎醫學部, 遼寧 錦州　121001;2. 武漢理工大學 化學化工與生命科學學院, 湖北 武漢　430070)

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微量熱法研究黃芪多糖對大腸桿菌的抑制功能及機理

任歷1, 廖曉宇1, 劉鵬2, 代春美1

(1. 遼寧醫學院 基礎醫學部, 遼寧 錦州121001;2. 武漢理工大學 化學化工與生命科學學院, 湖北 武漢430070)

通過微量熱法研究了pH、溫度、離子強度和黃芪多糖對大腸桿菌生長的影響,探討了黃芪多糖對大腸桿菌的抑制作用和機理。研究發現：pH降低到5或升高到9,或升高或降低溫度,大腸桿菌的生長代謝逐漸變慢,表現為停滯期增加,進入對數期的時間增加,最大放熱功率降低；適量NaCl(0.1mol/L)能夠刺激生長速率常數急劇上升；低劑量的黃芪多糖能夠刺激大腸桿菌的生長,但高劑量的黃芪多糖能夠抑制大腸桿菌,甚至能夠完全抑制。黃芪多糖的不斷加入,導致測量DPH的熒光偏振度逐漸提高,表明細胞膜通透性在逐漸增加,細胞膜的流動性卻在不斷降低,說明細胞膜逐步遭到了破壞。黃芪多糖存在下形成的抑菌圈為30mm左右,表明具有較強的抑菌功能。

黃芪多糖； 大腸桿菌； 微量熱法； 細胞膜

作為一種天然產物,黃芪具有提高免疫功能、延緩細胞衰老等功效[1]。在臨床應用中,黃芪還能夠減輕腎炎蛋白尿,增強心肌收縮的力量,以及調節血糖含量[2-3]。黃芪多糖是黃芪發揮藥理作用的主要成分。黃芪多糖是一種由多種單糖組成的生物大分子,由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成,具有抑制病毒、抑制腫瘤、延緩衰老、防止輻射、抗應激、防止氧化等作用[4-6]。黃芪多糖對多種致病菌均有抑制作用,如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、炭疽桿菌、溶鏈球菌肺炎雙球菌、沙門氏菌等。從中醫的角度來說,黃芪多糖主要通過調動機體免疫防御功能而發揮扶正祛邪抑菌,殺菌作用。但是從現代藥理學及分子生物學角度并未有完美的解釋。

微量熱法由于其靈敏度高,常被用于生物體系代謝過程的熱量。武漢大學劉鵬等[7-8]人率先在國內用微量熱法對細菌生長產熱曲線進行研究。

本文通過微量熱法研究黃芪多糖對大腸桿菌的抑制功能及機理。根據大腸桿菌在黃芪多糖作用下不同的新陳代謝的放熱曲線,反映出大腸桿菌的生長情況,以及黃芪多糖在不同的條件下效能的變化。離子強度、pH值和溫度對大腸桿菌生長的影響也通過微量熱發進行了詳細的研究。另外,結合大腸桿菌細胞膜的變化以及抑菌圈的大小探討了黃芪多糖抑制大腸桿菌生長的機理。

1　實驗

1.1主要藥品與試劑

黃芪多糖APS購置于陜西森弗生物技術有限公司。大腸桿菌(AB91112)購于武漢大學微生物保存中心。培養基：將5g的NaCl、5g的蛋白胨、5g的牛肉膏溶于1 000mL蒸餾水中,調節溶液pH值至7.2；在121 ℃、1.034×105Pa滅菌30min。

1,6-二甲苯-1,3,5-己三烯(DPH)購于Sigma。先將DPH溶于氯仿,然后將該溶液溶于pH值為7.2的磷酸緩沖液(PBS)中,使DPH濃度為0.004mmol/L,劇烈震蕩15min。

1.2微量熱儀

本研究中所使用儀器為瑞典ThermometricAB公司生產的8通道TAMAir等溫熱導式量熱儀器。樣品池和參比池周圍布滿了熱流傳感器，樣品和它的環境之間的溫差在該傳感器中形成一個正比于熱流速度的電勢信號。樣品池和參比池進行孿生式對接,這樣可以消除因外界溫度波動產生的背景噪聲。TAMAir結構示意圖見圖1。

圖1　TAM air的結構示意圖

1.3測試方法

實驗時系統控溫在37 ℃。當系統獲得了較為穩定的基線之后,在樣品池的瓶中加入接種了大腸桿菌的培養基,再加入一定濃度的黃芪多糖溶液(0、5×10-6、10×10-6、20×10-6、30×10-6、40×10-6、100×10-6mol/L)；之后放入TAMAir微量量熱儀中,計算機輸出并繪出大腸桿菌生長代謝的熱功率曲線。

用二次蒸餾水配制濃度為0.1mol/L的HCl溶液和1.0mol/L的NaCl溶液。用配置好的HCl溶液調節pH值,在pH為5.5和8.5時重復上述實驗。用配置好的NaCl溶液調節離子強度,分別加入不同量使NaCl的濃度為0.1、0.2、0.3mol/L,在不同的離子強度下重復上述實驗。

1.4細胞膜通透性的變化

熒光偏振儀的型號為Shimadzu,RF-5301。大腸桿菌細胞膜流動性的改變可以使用DPH作為探針,經由熒光偏振技術測得。將DPH溶于pH值為7.2的磷酸緩沖液(PBS)中,使DPH濃度為0.004mmol/L,劇烈震蕩15min,使其充分混合；用一定濃度的黃芪多糖溶液(0、5×10-6、10×10-6、20×10-6、40×10-6、40×10-6、100×10-6mol/L)處理培養好的大腸桿菌細胞；然后加入等量的DPH溶液,在37 ℃反應30min；用PBS洗滌幾次,充分去除溶液中游離的DPH,最后將細胞懸浮于PBS溶液中,測量細胞膜的偏振度。實驗采用的激發和發射波長分別為362nm和432nm。

1.5抑菌圈測試

取2個相同的培養皿,分別標記為A和B。在培養基中加入一定量的瓊脂(每100mL加1g瓊脂),經過高溫滅菌,未冷卻前倒入培養皿中,待冷卻后培養基凝固；將少量的大腸桿菌菌液分別加入到培養基上,并將其平鋪均勻。A組為對照組,兩組中在培養基表面取一個點,加入黃芪多糖溶液(100×10-6mol/L)；最后將A和B兩組均放在37 ℃恒溫培養箱中培養20h,觀察培養基表面大腸桿菌的生長狀況。

2　結果與討論

2.1pH、溫度和離子強度對大腸桿菌生長的影響

2.1.1pH對大腸桿菌生長的影響

圖2是37 ℃下大腸桿菌生長代謝曲線,可以區分出生長的4個階段：停滯期、對數生長期、穩定期和衰亡期。利用下式對生長代謝曲線進行處理：

lnPt=lnP0+kt

(1)

式中,Pt為放熱功率,P0為初始功率,t為時間。

在對數生長期中取Pt和t數據進行線性擬合,即可求出k值,從而得到細菌生長的速率常數[8-10]。大腸桿菌在不同pH值下生長的動力學方程見表1，表1中R為相關系數。

圖2　37 ℃下大腸桿菌不同pH值生長代謝放熱曲線

pH動力學方程k/min-1R7.2lnPt=-4.53+0.0065t0.00650.9995lnPt=-3.16+0.0048t0.00480.9999lnPt=-5.88+0.0037t0.00370.999

pH為7.2是對照組樣品,其表現出完整的生長4個階段,計算出生長速率常數為0.006 5min-1。隨著pH的降低到5,生長代謝逐漸變慢,表現為停滯期增加,進入對數期的時間增加,最大放熱功率降低,計算出其生長速率常數為0.00 48,pH降低,生長速率常數逐漸減小。隨著pH的升高到9,生長代謝逐漸變慢,表現為停滯期增加,進入對數期的時間增加,最大放熱功率降低到0.003 7。上述結果反映出了大腸桿菌與生長環境中pH值的關聯性。由圖2分析可知,大腸桿菌最適宜的生長條件為pH=7.2。一般來講,pH對細菌等微生物的生命活動有很大的影響,主要通過以下幾個方面實現:一是當pH值發生變化時,蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷會發生變化,從而影響其結構、生物活性和生理功能；二是引起細胞膜的電荷變化,導致微生物細胞與外界交換物質的能力受到影響,從而吸收營養物質能力改變。一般來講,不同微生物對pH值條件的要求各不相同,某一種微生物只能在一定的pH范圍內生長,而且這個pH范圍常限于一個較窄的范圍。微生物對環境的適應能力可以從對pH條件的要求不同反映出來。

2.1.2溫度對大腸桿菌生長的影響

大腸桿菌在不同溫度下生長代謝放熱曲線見圖3，動力學方程等見表2。

圖3　大腸桿菌在不同溫度生長代謝放熱曲線

溫度/℃動力學方程k/min-1R37lnPt=-4.53+0.0065t0.00650.99932℃lnPt=-4.02+0.0035t0.00350.99940℃lnPt=-2.67+0.0022t0.00340.999

由圖3可知,將溫度降到32 ℃或升到40 ℃時,生長代謝逐漸變慢,表現為停滯期增加,進入對數期的時間增加,最大放熱功率降低,計算出其生長速率常數分別為0.003 5min-1和0.003 4min-1，而37 ℃時的生長速率常數為0.006 5min-1。說明大腸桿菌最適合的生長溫度為37 ℃。在合理的溫度范圍內溫度的上升會加快細胞中的生物化學反應速率；但是酶、蛋白質和核酸等生物大分子參與的生化反應都有最適宜的溫度范圍,過高或過低的溫度使這些物質參與的生化反應會降低甚至停止，從而引起微生物生長的抑制,甚至死亡。所以每一種細菌都有一個最佳的平衡點和最適合生長的溫度。

2.1.3離子強度對大腸桿菌生長的影響

37 ℃下大腸桿菌在不同離子強度(NaCl濃度)下的生長代謝放熱曲線見圖4,動力學方程等見表3。

圖4　37℃下大腸桿菌在不同離子強度(NaCl濃度)下生長代謝曲線

NaCl濃度(mol·L-1)動力學方程k/min-1RControl(對照)lnPt=-4.53+0.0065t0.00650.9990.1lnPt=-3.02+0.0072t0.00460.9990.2lnPt=-2.67+0.0025t0.00250.9990.3lnPt=-4.53+0.0015t0.00150.999

由圖4可知，培養基加一點NaCl(0.1mol/L),生長速率常數就急劇上升,生長代謝逐漸加快,表現為停滯期縮短,進入對數期的時間縮短,最大放熱功率增加；進一步增加NaCl濃度,生長速率常數反而減小。NaCl濃度為0.1mol/L時,生長速率常數為0.0072min-1,NaCl濃度為0.2mol/L和0.3mol/L時的生長速率常數分別為0.002 5和0.001 5。離子強度反映溶液中離子的電性強弱的程度,而電性的強弱影響細胞膜的膜電位、滲透壓和通透性。低濃度NaCl能維持膜電位和滲透壓,適當保持細胞膜的通透性,高濃度破壞原有的平衡,結果是抑制細菌的生長。

2.2黃芪多糖對大腸桿菌生長的影響

如圖5和表4所示,當培養基加微量黃芪多糖,大腸桿菌生長受到了刺激,速率常數就上升；進一步增加黃芪多糖濃度,生長速率常數反而減小,黃芪多糖濃度為100×10-6mol/L時細菌無法生長。有機物是大腸桿菌的碳源,也是其能源,大腸桿菌將有機物作為細胞合成的碳源,所以低劑量的黃芪多糖能夠刺激大腸桿菌的生長,但高劑量的黃芪多糖能夠抑制大腸桿菌,甚至能夠完全抑制，這是因為黃芪多糖的生理生化功能引起的。

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成,是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。黃芪多糖特殊結構能夠插入到大腸桿菌的細胞膜中,改變細胞膜的結構,進而抑制了大腸桿菌的生長。

圖5　37 ℃下大腸桿菌在不同黃芪多糖含量下的生長代謝曲線

黃芪多糖含量(mol·L-1)動力學方程k/min-1RControllnPt=-4.53+0.0065t0.00650.9995×10-6lnPt=-2.38+0.0071t0.00460.99910×10-6lnPt=-1.53+0.0058t0.00250.99920×10-6lnPt=-3.23+0.0045t0.00150.99940×10-6lnPt=-3.29+0.0035t0.00650.99940×10-6lnPt=-4.66+0.0012t0.00460.999100×10-6—0

2.3處理后細胞膜流動性降低

細胞膜流動性是細胞膜的一項重要物理性能,很多生物功能如能量轉換、營養物質的吸收以及生物信號的傳遞,都與細胞膜流動性緊密聯系。因此,保持細胞膜流動性相對穩定,對于細菌正常代謝以及對抗各種環境不利因素有著重要的作用。

我們將細胞與DPH指示劑溫浴一段時間后,DPH會插入到細胞膜脂的疏水區域。因此通過測量DPH的偏振度可以間接測量出細胞膜的平均流動程度。熒光偏振度值與細胞膜流動性成反比,偏振度越大,說明細胞膜脂的流動性越小。細胞在光催化作用下發生的自由基損傷導致了膜的物化改變,膜流動性下降[11]。在本實驗中,自由基和紫外光都可以攻擊細胞表面的有機官能團,導致脂質氧化,磷脂分子排列更緊密,脂肪鏈流動性降低,進而導致整個細胞膜的流動性降低。隨著黃芪多糖的不斷加入,導致測量DPH的熒光偏振度值逐漸提高,表明細胞膜的通透性在逐漸增加,細胞膜的流動性卻在不斷降低,說明細胞膜逐步遭到了破壞[12-14]。黃芪多糖處理后大腸桿菌的熒光偏振值見圖6。

圖6　黃芪多糖處理后大腸桿菌的熒光偏振值

2.4抑菌圈

在已接種大腸桿菌的瓊脂培養基上加入少量黃芪多糖,使之接觸培養基和大腸桿菌,經培養一定時間后,因黃芪多糖的滲透擴散作用,黃芪多糖周圍因抑制了大腸桿菌的生長而產生了抑菌圈。從圖7可看出，對照組A周圍未形成抑菌圈,黃芪多糖處理組中的抑菌圈是大腸桿菌無法生長的區域。因此可以說明黃芪多糖確實可以抑制大腸桿菌的生長,其抑菌圈為30mm左右,表明具有較強的抑菌性能。

圖7　大腸桿菌在黃芪多糖存在下抑菌圈的形成

3　結論

(1) 本文通過微量熱法研究了pH、溫度、離子強度和黃芪多糖對大腸桿菌生長的影響,探討了黃芪多糖對大腸桿菌的抑制作用和機理。研究發現,pH降低到5或升高到9,生長代謝逐漸變慢,表現為停滯期增加,進入對數期的時間增加,最大放熱功率降低，反映出大腸桿菌與生長環境中pH值的關聯性，大腸桿菌最適宜的生長條件為pH=7.2。大腸桿菌最適合的生長溫度為37 ℃。適量NaCl(0.1mol/L)能夠刺激生長速率常數就急劇上升。離子強度表現了溶液中離子的電性強弱的程度,而電性的強弱影響了細胞膜的膜電位、滲透壓和通透性。低濃度的NaCl能維持膜電位和滲透壓,適當保持細胞膜的通透性,高濃度破壞原有的平衡,結果是抑制細菌的生長。

(2) 低劑量的黃芪多糖能夠刺激大腸桿菌的生長,但高劑量的黃芪多糖能夠抑制大腸桿菌,甚至能夠完全抑制。這是因為黃芪多糖生理生化功能引起的。黃芪多糖特殊結構能夠插入到大腸桿菌的細胞膜中,改變細胞膜的結構,進而抑制了大腸桿菌的生長。

(3) 黃芪多糖的不斷加入,導致測量DPH的熒光偏振度值逐漸提高,表明細胞膜的通透性在逐漸增加,細胞膜的流動性卻在不斷降低,說明細胞膜逐步遭到了破壞。

(4) 黃芪多糖存在下形成的抑菌圈為30mm左右,表明具有較強的抑菌性能。

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StudyoninhibitionandmechanismofastragaluspolysaccharideonEscherichia colibyusingmicrocalorimetry

RenLi1,LiaoXiaoyu1,LiuPeng2,DaiChunmei1

(1.DepartmentofBasicMedicine,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China;2.SchoolofChemistry,ChemicalEngineeringandLifeScience,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China)

TheeffectsofpH,temperature,ionicstrengthandAstragalusPolysaccharides(APS)onthegrowthofEscherichia coli (E. coli)werestudiedbymeansofmicrocalorimetrymethod.TheresultsshowthatwhenpHislowerthan5orhigher9,metabolismofE. coligrowthslowsdowngradually.Thesamephenomenoncanbeobservedunderdifferenttemperatureconditions.TheadditionofNaClcanstimulatethegrowthrateconstant.ThelowdoseofAPScanstimulatethegrowthofE. coli,butthehighdoseofAPScaninhibitE. coli,whichcanevenbecompletelyinhibited.InthepresenceofAPS,thepermeabilityofthecellmembranegraduallyincreased,evencellmembranewasdamaged.TheinhibitionzoneformedinthepresenceofAPSisabout30mm,whichindicatesthatithasstrongantibacterialfunction.

astragaluspolysaccharides; Escherichia coli;microcalorimetrymethod;cellmembrane

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.05.017

2015- 10- 20修改日期：2015- 12- 10

國家自然科學基金項目(51579159)資助;遼寧省教育廳課題(L2014332,L32013334)資助

任歷(1979—)，女,遼寧沈陽，在讀博士研究生，講師，研究方向為中藥質量評價、中藥有效成分臨床應用及相關機制研究.

E-mail：renli9705@163.com

R285.5

A

1002-4956(2016)5- 0058- 05