蛋白質層析系統在實驗教學中的應用

趙玉紅, 李　欣, 崔建林, 趙立青, 李小菊, 李登文, 張金紅, 周　浩

(1. 南開大學 生物實驗教學中心, 天津　300071； 2. 南開大學 醫學院, 天津　300071)

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蛋白質層析系統在實驗教學中的應用

趙玉紅1, 李欣1, 崔建林2, 趙立青1, 李小菊1, 李登文1, 張金紅1, 周浩1

(1. 南開大學 生物實驗教學中心, 天津300071； 2. 南開大學 醫學院, 天津300071)

設計“KTAprimeplus蛋白質層析系統純化綠色熒光蛋白(GFP)”的綜合實驗,以GFP蛋白為研究對象,在大腸桿菌中大量表達重組GFP蛋白,經鎳柱親和層析、離子交換層析以及凝膠過濾層析3種常用層析技術逐步純化,各步純化樣品經SDS-PAGE鑒定分析,最終獲得高純度的GFP蛋白。通過該實驗使學生深入、全面、系統地掌握生命科學研究中最新的蛋白質分離純化技術,提高學生的科研水平和綜合能力。

蛋白質層析系統； 蛋白質分離純化； 鎳柱親和層析； 離子交換層析； 凝膠過濾層析

隨著生命科學進入后基因組時代,蛋白質成為新的研究熱點[1-2],研究蛋白質對了解生命規律、指導工業生產、醫藥實踐有著重大的理論與實踐意義[3]。蛋白質的分離純化是蛋白質研究的基礎,獲得高純度且具有生物活性的蛋白質是研究其結構、功能與應用的前提。利用層析技術分離純化蛋白質所用條件溫和,不影響蛋白質原有的結構和生物活性,因而成為目前分離純化蛋白質的主要技術手段[4-5]。蛋白質層析系統為層析技術及其過程提供了穩定、準確、可靠的自動化平臺,能夠快速實現蛋白質的高效分離與純化,推進了以蛋白質研究為代表的一系列重大科學研究的進展,在科研以及生產實踐中有著廣泛的應用[6-9]。生命科學類學生掌握利用蛋白質層析系統及各種先進的層析技術分離純化蛋白質非常必要。

綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一種在美國西北海岸所盛產的水母中所發現的一種蛋白質。在其包含238個氨基酸的序列中,第65—第67個氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基可自發地形成一種熒光發色團[10-11],廣泛應用于蛋白質表達純化、蛋白質相互作用、蛋白質細胞內定位示蹤和模式生物轉基因等生物學研究中[12]。設計“KTAprimeplus蛋白質層析系統純化綠色熒光蛋白(GFP)”的實驗,以GFP蛋白為研究對象,在大腸桿菌中大量表達重組GFP蛋白,采用鎳柱親和層析、離子交換層析以及凝膠過濾層析3種常用層析技術逐步純化,并利用SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白純度鑒定。

1　實驗儀器

2　實驗材料與試劑

實驗材料：重組表達質粒(pET.M-GFP),大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)。

試劑：氨芐青霉素,IPTG,Tris,EDTA,NaCl,NiSO4,乙醇,MilliQ水,PMSF,SDS,過硫酸銨,TEMED,考馬斯亮蘭R250,甲醇,乙酸,蛋白質LoadingBuffer,低分子量蛋白Maker等。

預裝層析柱：鎳親和層析柱(HisTrapTMHP),分子篩層析柱(HiPrepTM16/60SephacrylTMS-200HR),離子交換柱(HiTrapTMDEAEFF,HiTrapTMCMFF)。

3　實驗方法

3.1表達GFP重組蛋白

將重組表達質粒(pET.M-GFP)轉化大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3),轉化后在100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,37 ℃過夜孵育；挑取轉化的單克隆菌落于5mL含有100μg/mLAmp的液體LB培養基中培養,220r/min,37 ℃,直至渾濁；再將5mL的LB培養液轉移到1L含有100μg/mLAmpLB培養基中繼續培養,220r/min,37 ℃,至OD值達到0.6；冰水混合物中降溫30min,每升菌液加300μL、1mol/L的IPTG,終濃度為300μmol/L,220r/min,16 ℃,誘導16～20h；5 000r/min,離心15min。

3.2GFP蛋白純化

3.2.1菌體超聲破碎

用30mLNi柱結合緩沖液A(5mmol/L咪唑,500mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HClpH7.9)重懸菌體沉淀,轉移至50mL離心管,添加蛋白酶抑制劑PMSF(1mmol/L)；將菌懸液冰上預冷,超聲破碎。程序：功率180W,超聲5s,間歇6s,循環重復26次,直至菌液不黏稠；破碎完成后,12 000r/min,4 ℃,離心40min。

3.2.2Ni親和層析

用Ni親和層析柱對裂解液上清進行初步純化;用結合緩沖液A平衡預裝HisTrapTMHP柱至基線平穩,上樣,用結合緩沖液A沖洗Ni柱直至UV值不再變化;將洗脫緩沖液B(1.0mol/L咪唑,500mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl,pH7.9)和結合緩沖液A形成咪唑梯度(設定程序：200mL,B：0～100%)洗脫目的蛋白;5mL每管收集蛋白洗脫液,SDS-PAGE電泳檢測,收集目的蛋白溶液,用Amicon濃縮筒濃縮。

3.2.3凝膠過濾層析

將濃縮后的蛋白樣品進一步經凝膠過濾柱純化。HiPrepTM16/60SephacrylTMS-200HR柱(柱體積120mL)用BufferA(BufferA：50mmol/LTris-HCl、pH7.5,50mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT)平衡1個柱體積；將濃縮后的蛋白樣品上樣,以2mL每管收集洗脫液,SDS-PAGE電泳檢測,收集目的蛋白。

3.2.4離子交換層析

將收集的蛋白樣品再進一步經離子柱純化。(1)BufferA(50mmol/LTris-HCl、pH7.5,50mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT)平衡預裝HiTrapTMDEAEFF陰離子交換柱至基線平衡,將凝膠過濾層析純化后的蛋白樣品上樣,用BufferA沖洗直到UV值降到不再變化。BufferB(50mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mol/LNaCl,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT)洗脫目的蛋白；2mL每管收集蛋白洗脫液,SDS-PAGE電泳檢測,收集目的蛋白溶液。(2)預裝HiTrapTMCMFF陽離子交換柱操作方法同(1)。

3.2.5SDS-PAGE凝膠電泳

配制5%的濃縮膠和12%的分離膠[13]。取10μL樣品與等體積2×蛋白loading混勻后,煮沸5min,冷卻上樣；穩壓80V,待樣品從濃縮膠進入分離膠后,將電壓調至160V,待指示染料遷移至下沿約1cm處停止電泳。電泳結束后,加入0.25%考馬斯亮藍染液(考馬斯亮藍R250 2.5g,無水乙醇250mL,冰乙酸80mL,水 670mL),微波爐高火煮2min；染色完畢,用水漂洗凝膠,微波爐水煮15min,2～3次,直至凝膠藍色背景退去、蛋白條帶清晰為止[14-15]。

3.2.6GFP蛋白保存

將純化好的蛋白溶液用Amicon濃縮筒濃縮到一定濃度,然后用nanodrop2000紫外分光光度計測定濃度,分裝之后保存到-80 ℃冰箱備用。

4　結果與分析

4.1Ni親和層析圖譜及SDS-PAGE檢測

重組表達的GFP蛋白在N端帶有6個組氨酸標簽,組氨酸與金屬鎳具有很強的親和作用,因此本實驗首先采用鎳親和層析對蛋白樣品進行初步純化。根據監測圖(見圖1),發現紫外吸收從第3管開始有升高跡象,在第7、第8管達到峰值,到第10管恢復到基線,于是對洗脫下來的3—10號管中的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖2)。實驗結果表明,鎳柱親和純化效果良好,GFP蛋白樣品中還存在少許雜蛋白,需進一步純化處理；通過與分子量Marker進行比較發現,GFP蛋白分子量約為27kDa,與理論值相符；其中第6—第8號管中GFP蛋白比較富集且純度較高,收集這3管蛋白,用Amicon濃縮筒濃縮至5mL,準備進一步純化處理。

圖1　Ni親和層析監測圖

圖2　Ni親和層析純化得到的GFP蛋白SDS-PAGE電泳結果

4.2凝膠過濾層析圖譜及SDS-PAGE檢測

將濃縮后的GFP蛋白進一步進行凝膠過濾層析純化,從監測圖(圖3)可以看出,出現兩個紫外吸收峰,從出峰位置以及峰面積可以大概判斷后面的主峰應該是GFP蛋白,前面的小峰可能是分子量大的雜蛋白,也可能是GFP蛋白的聚集體。另外,GFP蛋白的峰形相對比較對稱,表明蛋白構象相對較好。圖中的紅色線代表的是電導,間接表明了緩沖液的成分,GFP蛋白峰與后面的鹽峰分得非常開,表明GFP蛋白已經徹底通過凝膠過濾層析置換到預先平衡的低鹽緩沖液中,從而除去樣品中存在的大量咪唑和高濃度的NaCl,以利于下一步的離子交換層析。取30—38號管進行SDS-PAGE電泳檢測,結果見圖4，結果顯示蛋白純度進一步提高。

圖3　HiPrepTM 16/60 SephacrylTM S-200 HR凝膠過濾監測圖

圖4　凝膠過濾層析純化得到的GFP蛋白SDS-PAGE電泳結果

4.3離子交換層析圖譜及SDS-PAGE檢測

將凝膠過濾后的GFP蛋白分成兩份,再進一步用

離子交換層析進行其帶電性的分析。首先嘗試CM陽離子交換柱,發現GFP蛋白全部流出來,而沒有結合到柱子上,因為蛋白質本身能發出熒光,用肉眼很容易觀察到。GFP蛋白在pH7.5、50mmol/LNaCl的條件下沒有與CM陽離子交換柱結合,表明在此條件下GFP蛋白所帶電荷為負,因此采用DEAE陰離子交換柱。由圖5可看出，通過顏色明顯觀察到GFP蛋白結合到DEAE柱,設定程序,利用離子強度梯度把結合的GFP蛋白洗脫下來,圖5中的紅色線是電導線,表明在洗脫過程中離子強度是逐漸升高的。根據監測圖(圖5),對8—16號管中蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測并收集，結果見圖6。結果表明,收集的蛋白樣品純度很高,達到了分離純化GFP蛋白的目的。

圖5　HiTrapTM DEAE FF陰離子交換監測圖

圖6　離子交換層析純化得到的GFP蛋白SDS-PAGE電泳結果

4.4蛋白濃縮與濃度檢測

將經DEAE柱收集的蛋白樣品濃縮至1mL,用nanodrop2000進行濃度測定,結果吸光度A280為5.0左右,表明1L大腸桿菌最后得到了約5mg的高純度的重組GFP蛋白。

4.5注意事項

(1) 層析系統中所用buffer及樣品等均需要脫氣、過0.45μm濾膜處理,系統中不能有氣泡。

(2) 實驗結束后用20%乙醇沖洗管道,直至所有管道充滿20%乙醇。

(3) 實驗中確保層析柱承受壓力不要超過其能耐受的最大壓力。

(4) 鎳柱使用后,可以用Stripingbuffer(50mmol/LTris-HCl、pH7.9,200mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl)結合Chargebuffer(50mmol/LNiSO4),對鎳柱進行恢復和再生。

5　結論

(1) 本實驗綜合運用科研工作中常用的親和層析、凝膠過濾層析和離子交換層析對目的蛋白進行逐級純化。GFP蛋白帶有His標簽,首先采用親和層析,去除大部分雜蛋白,再根據GFP蛋白的分子大小

和帶電荷性質,進一步經凝膠過濾層析和離子交換層析純化,最終獲得大量高純度的GFP蛋白。

(2) 凝膠過濾層析是蛋白純化技術中常用的層析技術,實驗中使學生明確凝膠過濾層析操作不僅具有純化意義,還有將蛋白樣品置換至所需溶液以及分析蛋白構象的作用。

(3)GFP帶負電荷,可以結合陰離子柱,在分離純化過程中應該使用陰離子交換柱。但在離子交換層析實驗中,為模擬科研實踐,將GFP視為未知蛋白,采用陰陽兩種離子交換層析柱進行探究性實驗,培養學生的科研能力和綜合素質。

(4) 實驗對象GFP蛋白使得整個實驗過程中樣品及流動相的流路形象、直觀,有助于學生對所學知識及相關實驗技能的理解和掌握。

(5)SDS-PAGE凝膠電泳技術是生物學實驗中常用的一項重要技術,通過該實驗,可使學生充分掌握該項技術并學會綜合運用。

通過精心設計,使學生深入、全面、系統地掌握生命科學研究中最新的蛋白質分離純化技術并學會靈活運用,進而掌握一般生物大分子的分離純化技術,提高學生的科研水平和綜合能力。

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Applicationofproteinchromatographysysteminexperimentalteaching

ZhaoYuhong1,LiXin1,CuiJianlin2,ZhaoLiqing1,LiXiaoju1,LiDengwen1,ZhangJinhong1,ZhouHao1

(1.BiologicalExperimentalCenter,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;2.CollegeofMedicine,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

Thecomprehensiveexperimentof“AKTAprimeplusproteinchromatographysystempurifyinggreenfluorescentprotein(GFP) ”,wasdesigned.Thehigh-purityGFPproteinwillbepurifiedfromEscherichia colibynickelaffinitychromatography,ionexchangechromatographyandgelfiltrationchromatographycombinedwithSDS-PAGEanalysis.Students’scientificresearchlevelandcomprehensiveabilitywillbeimprovedthroughdeeply,comprehensivelyandsystematicallymasteringthelatestproteinseparationandpurificationtechnology.

proteinchromatographysystem;proteinseparationandpurification;nickelaffinitychromatography;ionexchangechromatography;gelfiltrationchromatography

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.05.015

2015- 11- 04修改日期：2015- 12- 24

國家基礎學科人才培養基金項目“南開大學生物學人才培養基地”(J1103503)；國家基礎學科人才培養基金“條件建設項目”(J1310003)；南開大學2014年教學改革項目

趙玉紅(1981—)，女，山東青島，碩士，實驗師，從事生物化學和分子生物學實驗教學工作

E-mail：zyh@mail.nankai.edu.cn

周浩(1981—)，男，湖北荊門，博士，副教授，從事蛋白質結構與 功能研究以及基于蛋白質結構的工程應用.

E-mail：haozhou@nankai.edu.cn

G642.0；Q503

A

1002-4956(2016)5- 0048- 04