氯化甲基汞對發育階段大鼠小腦 PKCδ mRNA及蛋白表達的影響①

張宏宇　劉忠山　王鐵君　李志超　郭　杰

(吉林大學第二醫院放療科,長春130041)

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氯化甲基汞對發育階段大鼠小腦 PKCδ mRNA及蛋白表達的影響①

張宏宇②劉忠山王鐵君李志超③郭杰

(吉林大學第二醫院放療科,長春130041)

①本文為吉林省衛生廳科研基金資助項目(3D5097923427)、吉林大學基本科研業務費專項基金資助項目(421030140427)、吉林大學青年教師基金資助項目(419070210048)。

②中國人民解放軍208醫院461臨床部,長春130061。

③吉林大學公共衛生學院，長春130061。

目的：觀察氯化甲基汞對發育大鼠小腦中 PKCδ mRNA 及蛋白表達的影響。方法：建立發育大鼠小腦甲基汞損傷實驗模型。采用核酸原位雜交方法(In Situ Hybridization, ISH )檢測 δ 型蛋白激酶 C(PCKδ) mRNA 表達。采用Western blot方法檢測PKCδ蛋白表達。結果：實驗組和對照組仔鼠在出后就即可檢測到小腦蒲肯野細胞 PKCδ表達，且隨生后時間延長表達水平雖有增高但幅度很小。各實驗組仔鼠腦汞含量明顯高于對照組，且實驗組小腦蒲肯野神經元PKCδmRNA表達陽性率及小腦組織胞漿和胞膜PKCδ蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。結論：氯化甲基汞以劑量依賴方式和時間依賴方式促進仔鼠小腦蒲肯野細胞 PKCδmRNA及蛋白表達。 PKCδ亞類可能是甲基汞介導神經毒作用的關鍵靶分子。

氯化甲基汞;腦發育;PKCδ expression

氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC) ，是一種親脂性有機汞的環境污染物,極易透過血腦屏障，具有強烈的神經毒性作用[1-3]。既往的研究結果發現甲基汞可導致幼鼠腦神經細胞凋亡，引起發育階段大鼠海馬組織胞漿及胞膜蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)活性升高，并且以劑量依賴方式和時間依賴方式促進仔鼠小腦蒲肯野細PKCαmRNA表達[4-6]。另外，我們還觀察到氯化甲基汞可以誘導腦膠質瘤細胞凋亡[7]。基于前述研究的結果，我們認為PKC可能是氯化甲基汞神經毒作用機制中的關鍵靶標。PKCδ是鈣離子依賴型蛋白激酶, 是細胞增殖分化及凋亡信號通路中的關鍵分子，但其對中樞神經系統發育、分化的影響尚不清楚[8,9]。 因此本研究在建立甲基汞致大鼠小腦發育損傷模型的基礎上,采用核酸原位雜交及Western blot方法觀察氯化甲基汞對發育大鼠小腦 PCKδ 在mRNA和蛋白質水平上表達的影響，旨在深入研究甲基汞神經毒作用的分子機制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器FV500 激光共聚焦顯微鏡 Olympus,日本； MMC 德國 Merck 公司。ISH檢測試劑盒,武漢博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1慢性氯化甲基汞暴露小腦發育損傷動物模型的建立，詳見引文[4]。

1.2.2腦汞含量測定采用干燒法測定，詳見引文[4]。

1.2.3ISH石蠟切片二甲苯脫蠟,乙醇梯度復水,預雜交,雜交,顯色,相同區域顯微鏡下在同一放大倍數下計數，計10 個不同視野的陽性細胞數和細胞總數,計算陽性率。

1.2.4免疫印跡法(Western blot )腦組織樣品制備:分離細胞漿PKC取鼠腦稱重，加入勻漿緩沖液(50 mmol/L Tris-HCL pH7.5,0.32 mmol/L sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)。超聲粉碎20 s共3次，每次間隔20 s。100 000 r/min 4℃，離心1 h。將上清，沉淀分開待用。

分離細胞膜PKC：用勻漿緩沖液含(1%Triton-X100，50 mmol/L Tris-HCl pH7.5,0.32 mmol/L Sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)將沉淀懸起，100 000 r/min 4℃，離心1 h，留取上清。

蛋白質濃度測定：采用Bradford(1976)法[10]。

樣品制備及SDS-PAGE電泳提取的樣品蛋白定量后，置于1×SDS上樣緩沖液中，100℃煮沸3min使蛋白變性，每道上樣量為50 μg/20 μl。接通電源，凝膠上所加電壓8 V/cm。顏料前進至分離膠后，電壓提高至15 V/cm,繼續電泳至溴酚蘭達到分離膠底部。

蛋白質的電轉移：電泳后切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜，將它們浸泡于轉移緩沖液中，在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，各層之間精確對齊且無氣泡存在，將支架夾扣扣緊后，置于電轉移槽中，硝酸纖維素膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加入轉移緩沖液和冰盒，30 V電壓過夜轉移。

封閉：電轉移結束后，將封閉液均勻加至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，以封閉無關蛋白質結合位點。轉移后凝膠用考馬斯亮蘭染色，檢查蛋白是否轉移完全。

抗體的結合：封閉后的硝酸纖維素膜用PBST漂洗3次，每次5 min。以抗體稀釋液稀釋一抗。取一保鮮膜，四角固定于大平皿上，滴加一抗溶液，將硝纖膜覆蓋在該溶液上(注意：轉移面與抗體溶液接觸)，37℃反應2 h。洗滌后的膜按同樣方法與二抗溶液反應2 h。暗室中顯影目標蛋白帶，采用ImageQuantTMTL分析條帶灰度。

2　結果

2.1MMC母鼠喂養對仔鼠小腦汞含量的影響MMC 染毒的實驗組仔鼠小腦汞含量均明顯高于對照組(P<0.001),并且隨母鼠接觸 MMC 劑量的增多而增高(P<0.001) 。 三種濃度的實驗組仔鼠小腦汞含量在出生后均隨時間的延長而有不同程度升高,且均明顯高于相應對照組(P<0.001) 。

2.2氯化甲基汞對仔鼠小腦 PKCδ mRNA 表達的影響大鼠初出生PKCδ mRNA即可廣泛高水平表達于新生鼠小腦皮質蒲肯野神經元。同時我們發現新生大鼠小腦顆粒及分子層細胞PKCδ mRNA表達量極低。隨生后時間的延長，PKCδ表達水平雖有增高但幅度很小，這與我們以往觀察PKCα mRNA表達隨生后時間延長而遞增的表達模式不同[6]。我們提取實驗組生后不同時間仔鼠小腦組織測定汞含量計數PKCδ mRNA陽性表達細胞，發現隨腦汞含量增加實驗組仔鼠小腦蒲肯野細胞PKCδmRNA表達陽性率明顯升高(P<0.05)，并且這種表達變化呈現劑量-效應模式。與對照組相比，PKCδmRNA陽性表達細胞在3個劑量水平氯化甲基汞攝入組分別增加了8.8%，16.9%，24.6%。見圖1。

2.3氯化甲基汞對仔鼠小腦 PKCδ 蛋白表達的影響采用Western blot法在蛋白質水平檢測PKCδ腦表達，研究觀察到與ISH方法檢測一致的結果，即PKCδ蛋白在仔鼠初出生后就廣泛高表達于小腦組織胞漿和胞膜,在生后30 d達峰值。且實驗組仔鼠小腦組織胞漿和胞膜PKCδ蛋白表達水平均明顯高于對照組(見表1及圖2)。

圖1　MMC慢性暴露對PKCδ mRNA 表達的影響Fig.1　Time-courses change pattern of PKCδ mRNA expression in postnatal rat cerebellumNote: *.P<0.001.

表1　Western blot法檢測不同濃度氯化鉀基汞對仔鼠腦神經元胞膜及胞漿PKCδ蛋白表達條帶灰度值的影響Tab.1　Expression of PKCδ in cytosol and membrane of PND30 rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups by Western blot analysis

圖2　Western blot法檢測仔鼠小腦神經元胞膜及胞漿PKCδ蛋白表達Fig.2　Representative immunoblots showing protein expression of PKCδ in rat cerebellum from Western blot analysisNote: All postnatal cerebellum samples were from rats of a single litter.The molecular weights for PKCδ subunit is 76 kD.

3　討論

PKC在機體對外界刺激產生反應的信號通路中起重要作用，是信號通路的中心分子，參與細胞增殖、分化、凋亡及癌變，與細胞信息傳遞、細胞分泌、細胞膜離子通道調節等重要生理過程。PKCδ 作為PKC家族中的關鍵分子，發揮著重要的生理學功能，它是一類鈣離子依賴性的 PKC 亞類蛋白,處于增殖分化期的神經細胞中檢測到PKCδ高表達，PKCδ低表達于成熟的神經組織, PKCδ的功能與神經元細胞的死亡和/或凋亡密切相關[11]。本研究中我們在mRNA和蛋白質水平上觀察到PKCδ在仔鼠出生即出現高表達。這一結果與既往我們研究中觀察到的PKCα的表達不同[6]。提示PKC不同亞類之間表達模式不同，在神經系統發育過程中的作用不同。在本研究MMC 致小腦發育損傷大鼠模型中,觀察到隨著腦汞含量的增加PKCδ mRNA 和蛋白質表達上調,且這種變化呈劑量依賴性關系。提示 PKCδ 可能是MMC 致腦發育損傷的關鍵靶分子。根據以往MMC理化特性及神經細胞發育信號通路的研究成果，我們分析其可能的機制與以下因素有關[12-15]：(1)PKCδ 激活后,上調 Fos 蛋白表達,促進蛋白酶、核酸內切酶的合成和活化,加速細胞凋亡;(2)作用細胞色素 C 釋放,誘導神經細胞凋亡及損傷；(3)促進TNF-δ 釋放增加,趨化炎細胞局部浸潤, 加重腦組織損傷和細胞壞死凋亡。另外，我們既往的研究還觀察到氯化甲基汞可以誘導腦膠質瘤細胞凋亡，提示甲基汞可能具有潛在的抗腫瘤活性，其確切的機制有待于進一步研究。

[1]Boischio A.Developmental neurotoxicity:methylmercury and prenatal exposure protection in the context of the Minamata Convention[J].Rev Panam Salud Publica，2015，38(3):243-247.

[2]Farina M,Aschner M,Rocha JB.Oxidative stress in MeHg-induced neurotoxicity [J].Toxicol Appl Pharmacol, 2011,256(3):405-417.

[3]Sadiq S,Ghazala Z, Chowdhury A,etal.Metal toxicity at the synapse:presynaptic, postsynaptic, and long-term effects[J].J Toxicol，2012,2012:132671-132682.

[4]郭杰,王鐵君,張雯艷,等.氯化甲基汞對發育階段大鼠海馬組織蛋白激酶 C 活性的影響[J] 吉林大學學報(醫學版),2010,36 (5):922-925.

[5]郭杰,張雯艷 ，王鐵君,等.氯化甲基汞誘導大鼠不同發育階段腦神經細胞凋亡[J].中國免疫學雜志，2013，29(6)596-599.

[6]郭杰，張宏宇，張雯艷,等.氯化甲基汞對仔鼠小腦 PKCα mRNA 表達的影響[J].中國免疫學雜志，2013；29(9)923-925.

[7]柳影,陳儇, 郭杰,等.氯化甲基汞對人SHG44膠質瘤細胞抗腫瘤活性的體外實驗研究[J].中國實驗診斷學，2010，14(4)：475-478.

[8]Berardi DE, Bessone MI, Motter A,etal.Involvement of protein kinase C α and δ activities on the induction of theretinoic acid system in mammary cancer cells[J].Mol Carcinog，2015,54(10):1110-1121.

[9]Xu B,Xu ZF,Deng Y,etal.MK-801 protects against Intracellular Ca2+overloading and improves N-methl-d-aspartatereceptor expression in cerebral cortex of methylmercury-poisoned rats [J].J Mol Neuro,2013,49(1):162-171.

[10]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976, 72:248-254.

[11]Yasuyoshi Y,Freesia LH,Hiroki N,etal.Tissue distribution and developmental expression of protein kinase C isozymes[J].J Biol Chem,1994,263(20):9868-9873.

[12]Kunimoto M.Methylmercury induces apoptosis of rat cerebellar neurons in primary culture[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,204(1):310-317.

[13]Soh JW,Lee EH,Prywes R,etal.Noval roles of specific isoforms of protein kinase C in activation of the c-fos serum response element[J].Mol cell Biol,1999,19:1313-1324.

[14]Leverrier S,Vallentin A,Joubert D.Positive feedback of protein kinase C proteolytic activation during apoptosis[J].Biochem J,2002,368(Pt 3):905-913.

[15]Romanova LY,Alexandrov IA,Blagosklonny MV,etal.Regulation of actin cytoskeleton in lymphocytes:PKC-delta disrupts IL-3-induced membrane ruffles downstream of Rac1[J].J Cell Physiol,1999,179(2):157-169.

[收稿2016-01-23]

(編輯張曉舟)

Effects of Methylmercury chloride exposure on PKCδ expression in rat developmental cerebellum

ZHANG Hong-Yu，LIU Zhong-Shan，WANG Tie-Jun，LI Zhi-Chao, GUO Jie.Department of Radiotherapy,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China

Objective:To investigate the effect of Methylmercury chloride chronic exposure on PKCδ expression developing cerebellum.Methods: Establishment of cerebellum damage model of developmental rats by chronic MMC exposure.In Situ Hybridization and Western blot analysis were performed to detect the expression of PKC isozyme.Results: PKCδ was expressed at high levels at birth, but no significant change was observed with the increase in the time of birth corresponding to brain Hg2+level, expression of PKCδ in cerebellum of experimental groups was markedly higher than that of control group.Conclusion: Neurotoxicity of Methylmercury chloride exposure might be mediated by PKCδ expression up-regulating in developmental cerebellum.

Methylmercury chloride;Brain development;PKCδ expression

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.024

R135.13文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1192-03

張宏宇(1972年-)，男，藥學碩士，主治醫師，主要從事重金屬神經毒作用機制的研究，E-mail:xmj770818@sina.com。

及指導教師：郭杰(1973年-),女,博士,副教授,主要從事惡性腫瘤治療方面的研究, E-mail:guojie@jlu.edu.cn。