夏天無注射液參與腦缺血再灌注大鼠神經保護的NF-κB介導機制①

徐祖才　張莎莎　梁　濤　王　靜　彭　燕　張　駿

(遵義醫學院附屬醫院神經內科，遵義563003)

?

夏天無注射液參與腦缺血再灌注大鼠神經保護的NF-κB介導機制①

徐祖才張莎莎②梁濤王靜③彭燕張駿

(遵義醫學院附屬醫院神經內科，遵義563003)

①本文為國家自然科學基金項目(81460191)及貴州省科學技術基金(黔科合J字[2011]2270)。

②共同第一作者,濱州醫學院附屬醫院 健康體檢管理部，濱州256603。

③遵義醫學院附屬醫院神經內科 預防保健科，遵義563003。

目的：探討夏天無注射液參與腦缺血再灌注大鼠神經保護的NF-κB介導機制。方法：隨機將雄性SD大鼠分為假手術組、模型組、夏天無注射液1.0 ml/kg的低劑量組、2.5 ml/kg的中劑量組、5 ml/kg的高劑量組及NF-κB抑制劑(BAY11-7082)組。腦缺血再灌注24 h后，2,3,5氯化三苯基四唑(TTC)染色檢測各組大鼠腦梗死重量百分比；免疫組織化學技術及Western blot技術檢測各組的磷酸化NF-κB表達變化。結果：TTC發現：不同劑量的夏天無注射液及BAY可以減輕腦梗死的總量，其中，高劑量組、中劑量組及抑制劑組之間效果無差異，但三者效果均較低劑量組明顯；免疫組化發現：主要在模型組中的海馬CA1區細胞核中發現磷酸化NF-κB 表達，而CA3區的表達量較少。Western blot檢測發現：不同劑量的夏天無注射液可以模擬BAY11-7082的作用，降低磷酸化NF-κB蛋白的表達量。結論：夏天無注射液可能減輕大鼠腦缺血再灌注后梗死程度，其機制可能是通過抑制NF-κB的過度磷酸化。

夏天無注射液;腦缺血再灌注;NF-κB;神經保護

卒中是全球范圍內導致死亡的第二大常見疾病，約占11.9%，平均每年約670萬人死于卒中，其中缺血性腦卒中約占80%～90%[1]。與缺血性卒中相關的研究不乏提示炎癥相關因子的重要作用[2]。氧糖剝奪所引起的缺血中心區神經細胞死亡，造成神經損傷，而炎癥主要導致缺血半暗帶神經細胞死亡[3]。炎癥細胞的產生及炎癥因子的釋放進一步加重神經細胞損傷及增加梗死面積[4]。NF-κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activat-ed B cells)廣泛存在于真核細胞內,其在B淋巴細胞中檢測到，對多種基因轉錄進行調控[5,6]。NF-κB是炎癥反應中一種重要的蛋白復合物，它可以被許多炎性分子激活，進而啟動炎性細胞因子的表達及細胞凋亡，且與腦損傷相關[7]，注射用夏天無總堿對大鼠局灶性腦缺血損傷具有治療作用，其機制可能與保護神經元、抗神經元凋亡以及調控突觸可塑性有關[8]。隨著對腦缺血再灌注損傷及夏天無研究的研究,抗炎治療能否成為治療缺血性腦損傷的靶點，越來越受到關注。本研究擬通過造模后肌肉注射夏天無注射液及尾靜脈注射NF-κB抑制劑BAY 11-7082[9]，通過對腦梗死的重量的測定，免疫組化及免疫印跡對NF-κB進行檢測，揭示夏天無注射液對缺血再灌注腦損傷所起到的神經保護作用及其發生機制。

1　材料與方法

1.1實驗相關試劑江西天施康提供夏天無注射液，從碧云天生物技術公司購買BAY 11-7082，自基因科技上海有限公司購買抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒，自美國Sigma公司購買抗兔和抗小鼠IgG-HRP以及三羥甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清白蛋白(BSA)和G-250考馬斯亮藍等Western blot所需試劑，自美國Santa公司購買兔抗磷酸化NF-κB抗體及小鼠抗β-actin抗體一抗。

1.2方法

1.2.1腦缺血再灌注大鼠模型制備及分組腹腔注射3.5 ml/kg的10%的水合氯醛進行麻醉，將四肢和頭部予以固定，對頸部備皮，行2.0 cm左右的正中切口，先后分離出右頸總動脈(Common carotid artery，CCA)、頸外動脈(External carotid artery，ECA)及頸內動脈(Internal carotid artery，ICA)，結扎ECA近心端，在頸總動脈分叉處約4 mm 處開小口，把MCAO栓線圓頭端經CCA進入ICA，直至遇阻力停止，均入線長約18～20 mm，對頸內動脈結扎，縫合手術處，將栓線留置切口外以便拔除。栓塞2 h后將栓線頭端拉至頸內、外動脈分叉處，即可再灌注,進行評分，評分標準如下：0分，無神經損害癥狀；1分，左側前爪不能完全伸展；2分，向左側轉圈；3分，行走時向左側傾倒；4分，不能自發行走。評分>2分,即認為造模成功，納入正式實驗。假手術組處理步驟同上，但MCAO栓線進線深度限于10 mm，不阻塞大腦中動脈血流。隨機選擇清潔級SD雄性大鼠60只(250～300 g),購于第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心[許可證號：SCXK(渝)2007-0005]。隨機分為模型組，假手術、夏天無注射液1.0 ml/kg的低劑量組、2.5 ml/kg的中劑量組、5 ml/kg的高劑量組及NF-κB抑制劑BAY 11-7082(10 mg/kg)組，尾靜脈注射,各組大鼠均在缺血再灌注前0.5 h用藥(各組大鼠n=5)。

1.2.2TTC檢測不同組大鼠腦梗死體積變化缺血再灌注后24 h，斷頭取腦后，迅速將組織放入-20℃冰箱，15 min后取出，用手術刀片沿冠狀面自前向后于腦前極與視交叉連線中點處、視交叉處．漏斗柄部、漏斗柄與后葉尾極之間將腦組織均勻切為5等份，將腦片置于1%的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)中，避光孵育 30 min(37℃)，10 min后翻面。染色后正常腦組織呈現紅色，呈蒼白色的為梗死腦組織，其間界限分明。0%甲醛避光固定，24 h后取出，依次排列后拍照，后分離蒼白色的梗死區和紅色的非梗死區，后再稱重[梗死重量百分比計算法如下：梗死重量百分比(%)=蒼白區重量/全腦重量×100%]。

1.2.3取材切片及免疫組化腦缺血再灌注24 h后，將大鼠麻醉固定，迅速開胸，將心臟暴露，由左心室插入透灌針至主動脈，剪開右心耳，先用生理鹽水灌注沖洗，當流出的液透亮，改用4%多聚甲醛灌流固定，直至大鼠頸部僵硬，斷頭取腦，并迅速將腦組織在4%多聚甲醛中固定過夜，后進行石蠟包埋，切片。組化前，現對切片常規脫蠟水化，3%H2O2室溫避光孵育10 min，滴加磷酸化NF-κB一抗(1：200，陰性對照使用PBS)，4℃過夜，滴加二抗(37℃孵育30 min)，清洗后滴加DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，Leica光學顯微鏡觀察免疫組化結果，拍照記錄。

1.2.4Western blot取海馬組織勻漿，加入裂解液(含PMSF，pH7.4)后離心。將上清加入RIPA(含蛋白酶抑制劑)稀釋蛋白沉淀，分裝并凍存于-80℃冰箱。按BCA 法,定量至5 μg/ μl，加入等量×2上樣緩沖液，置于沸水中煮沸變性(約5～10 min)，于-20℃冰箱凍存備用。磷酸化NF-κB蛋白測定：等量蛋白樣品(每個泳道20 μl)經10%SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉法電轉移到PVDF 膜上。將已轉膜凝膠置于考馬斯亮藍染液(約30 min)，脫色液予以洗滌，測凝膠內蛋白是否轉移完全，后將PVDF 膜置于封閉液內(37℃，約1.5 h)，再加稀釋好的一抗磷酸化NF-kB(1∶5 000)，4 ℃冰箱中過夜，再用TBST液洗膜，加人二抗(抗兔IgG-HRP，1∶5 000)，(37℃，孵育約1 h)，后洗膜，再用BeyoECL Plus顯色，膠片曝光顯影，所得結果使用Quantity one進行分析。

2　結果

2.1不同劑量的ICDP均可減輕腦缺血再灌注大鼠腦梗死程度 TTC結果發現(圖1、2及表1)：假手術組中未見明顯腦梗死灶；模型組中，大鼠腦梗死程度較重(20.34±1.29)，然而，高(8.08±1.36)、中(8.57±1.49)和低(13.44±0.99)劑量的ICD及NF-κB 的抑制劑BAY 11-7082(8.64±1.49)均可使得相應組別大鼠腦梗死程度減輕。

2.2免疫組化檢測不同劑量ICDP對腦缺血再灌注大鼠腦海馬組織磷酸化NF-κB影響如圖3所示(×400)，磷酸化NF-κB主要表達在細胞胞核中，在胞漿中表達量較少，主要表達部位在大鼠腦海馬組織的CA1區，而少量在CA3區，并且，在模型組中表達最為明顯，而在假手術組、不同劑量ICDP干預組及BAY 11-7082組中細胞核中表達不明顯。

圖1　腦缺血后腦組織切片TTC染色Fig.1　TTC staining of brain sections after cerebral infarctionNote: A.Model group;B.Sham surgery group;C.ICDP-H(5 ml/kg) group;D.ICDP-M( 2.5 ml/kg) group;E.ICDP-L(1 ml/kg) group;F.BAY 11-7082(10 mg/kg) group.

圖2　不同劑量ICDP對大鼠腦缺血再灌注腦梗死重量的影響±s，n=5)Fig.2　Effect of ICDP on brain infarct weight in ischemia-reperfusion injury of rat ±s，n=5)Note: *.P<0.05.

2.3ICDP對腦缺血再灌注大鼠腦組織 NF-κB蛋白印跡的檢測Western blot檢測結果表明，假手術組可少量表達NF-κB蛋白(0.30±0.03)；與模型組比較(1.05±0.05)，夏天無高(0.57±0.02)、中(0.59±0.03)、低(0.62±0.03)劑量組及BAY 11-7082組(0.42±0.01)蛋白表達明顯減少(P<0.01)(圖4及表2)。

表1　不同組別大鼠腦缺血再灌注腦梗死重量重復測量方差分析結果Tab.1　ANOVA for repeated measurements in brain infarct weight after ischemia-reperfusion in different groups

圖3　ICDP對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織磷酸化NF-κB p65表達的影響Fig.3　Effect of ICDP on expression of phosphorylated NF-κB p65 in ischemia-reperfusion injury of rat brainNote: A.BAY 11-7082(10 mg/kg) group;B.ICDP-L(1 ml/kg) group;C.ICDP-M( 2.5 ml/kg) group;D.ICDP-H(5 ml/kg) group;E.Sham surgery group;F.Model group.

圖4　ICDP對缺血再灌注大鼠腦組織p-NF-κB表達的影響Fig.4　Effect of ICDP at expression of p-NF-κB in ischemia-reperfusion injury of rat ±s，n=5 )Note: *.P<0.05；#.P<0.05.

表2　不同組別大鼠腦缺血再灌注后腦組織p-NF-κB重復測量方差分析結果Tab.2　ANOVA for repeated measurements in expression of p-NF-κB in ischemia-reperfusion injury in different groups

3　討論

本實驗所用模型可模擬人腦缺血再灌注損傷過程，選用ICDP進行中藥治療，并以NF-κB信號通路的特異性抑制劑BAY11-7082為對照，從大鼠腦梗死體積及NF-κB磷酸化水平的變化，來檢測ICDP的療效。腦組織缺血后造成損傷的因素較多，可以表現為興奮性氨基酸毒性作用、鈣超載、自由基反應、炎癥和細胞凋亡[10,11]。本實驗結果對于對夏天無注射液對腦缺血再灌注后神經保護機制的研究具有重大意義。其中TTC染色可清晰、直觀的顯示腦組織的梗死區域，且發現了ICDP各劑量組同BAY 11-7082組一樣，可使得大鼠腦梗死體積縮小。其結果表明ICDP可以顯著減輕大鼠缺血再灌注后腦損傷，具有神經保護作用，其機制可能與NF-κB信號通路相關。

已有研究表明NF-κB對參與了缺血性腦卒中損傷[12]。NF-κB包含 IκB 依賴性的經典和非經典途徑[13]。當感受到各種細胞內外因素時，IκB激酶活化，繼而磷酸化及泛素化，并釋放出多個NF-κB二聚體，消除了IκB的抑制作用[14,15]。具核定位功能的p50協助RelA(p65)核轉移，繼而翻譯及修飾，NF-κB二聚體進一步活化，與目的基因及特定DNA序列結合，調控靶基因的轉錄[16]。Bay11-7082可通過抑制IkB磷酸化，而抑制NF-κB的活化，從而發揮其生物學效能[17]。本實Western blot結果發現Bay11-7082和ICDP各劑量組均可明顯抑制NF-κB磷酸化。免疫組化發現磷酸化NF-κB主要在胞核中表達，而ICDP及Bay11-7082均抑制了磷酸化NF-κB 的核轉移。

NF-κB信號通路與甲狀腺癌及血液系統相關疾病之間具有相關性，并且，其BAY 11-7082能有效抑制碘131誘導的NF-κB相關的細胞凋亡，且能改變血小板的形狀及其播散狀態，從而起到相應的療效[18]。通過本實驗也發現，抑制過度磷酸化的NF-κB可以較好地保護缺血再灌注后腦組織的損傷，因此，本研究為尋求腦缺血后再灌注損傷的臨床治療新策略提供了實驗基礎。

[1]Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,etal.Executive summary:Heart disease and stroke statistics--2013 update:A report from the american heart association [J].Circulation,2013,127(1):143-152.

[2]Ahmad M,Graham SH.Inflammation after stroke:Mechanisms and therapeutic approaches [J].Translational Stroke Res,2010,1(2):74-84.

[3]Candelario-Jalil E.Injury and repair mechanisms in ischemic stroke:Considerations for the development of novel neuroth-erapeutics [J].Curr Opin Investig Drugs(London,England :2000),2009,10(7):644-654.

[4]Macrez R,Ali C,Toutirais O,etal.Stroke and the immune system:From pathophysiology to new therapeutic strategies [J].Lancet Neurol,2011,10(5):471-480.

[5]van der Kooij MA,Nijboer CH,Ohl F,etal.Nf-kappab inhibition after neonatal cerebral hypoxia-ischemia improves long-term motor and cognitive outcome in rats [J].Neurobiol Disease,2010,38(2):266-272.

[6]Fan H,Li L,Zhang X,etal.Oxymatrine downregulates tlr4,tlr2,myd88,and nf-kappab and protects rat brains against focal ischemia [J].Mediators of inflammation,2009,2009:704-706.

[7]Dabek J,Kulach A,Gasior Z.Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated b cells(nf-kappab):A new potential therapeutic target in atherosclerosis? [J].Pharmacological reports,2010,62(5):778-783.

[8]姚麗梅,劉瑤,段啟.注射用夏天無總堿對大鼠局灶性腦缺血的影響 [J].中成藥,2011,33(5):872-874.

[9]Alvira CM,Abate A,Yang G,etal.Nuclear factor-kappab activation in neonatal mouse lung protects against lipopolysacc-haride-induced inflammation [J].Am J Respiratory Critical Care Med,2007,175(8):805-815.

[10]Zador Z,Benyo Z,Lacza Z,etal.[Neuroprotection in brain ischemia-doubts and hopes][J].Ideggyogyaszati szemle,2004,57(3-4):81-93.

[11]Fagan SC,Hess DC,Machado LS,etal.Tactics for vascular protection after acute ischemic stroke [J].Pharmacotherapy,2005,25(3):387-395.

[12]Harari OA,Liao JK.Nf-kappab and innate immunity in ischemic stroke [J].Annals NY Acad Sci,2010,1207:32-40.

[13]Tamatani M,Che YH,Matsuzaki H,etal.Tumor necrosis factor induces bcl-2 and bcl-x expression through nfkappab activation in primary hippocampal neurons [J].J biological chem,1999,274(13):8531-8538.

[14]Saji C,Higashi C,Niinaka Y,etal.Proteasome inhibitors induce apoptosis and reduce viral replication in primary effusion lymphoma cells [J].Biochemical Biophysical Res Communications,2011,415(4):573-578.

[15]Spinelli SL,Casey AE,Pollock SJ,etal.Platelets and megakaryocytes contain functional nuclear factor-kappab [J].Arterioscle Thromb Vasc Biol,2010,30(3):591-598.

[16]Pfeffer LM.The role of nuclear factor kappab in the interferon response [J].J Interferon Cytokine Res,2011,31(7):553-559.

[17]Ma W,Dumont Y,Vercauteren F,etal.Lipopolysaccharide induces calcitonin gene-related peptide in the raw264.7 macrophage cell line [J].Immunology,2010,130(3):399-409.

[18]Meng Z,Lou S,Tan J,etal.Nuclear factor-kappa b inhibition can enhance apoptosis of differentiated thyroid cancer cells induced by 131Ⅰ[J].PloS One,2012,7(3):e33597.

[收稿2016-01-25修回2016-04-21]

(編輯許四平)

Study of mechanism on NF-κB mediates injection coryadlis decumbens pers participated in neuroprotection after ischemia reperfusion of rats

XU Zu-Cai，ZHANG Sha-Sha，LIANG Tao，WANG Jing，PENG Yan，ZHANG Jun.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003,China

Objective:To investigate themechanism on NF-κB mediates the injection coryadlis decumbens pers(ICDP) participated in neuroprotection after ischemia reperfusion of rats.Methods: The SD rats were rando mly divided into several groups as follows:Sham operation group,Model group,1.0 ml/kg ICDP group(Low-dose,ICDP-L),2.5 ml/kg ICDP group(Middle-dose,ICDP-M),5 ml/kg ICDP group(High-dose,ICDP-H),and NF-κB inhibitor group(BAY11-7082).24 h after anesthetize，the volume of infarct sections in different groups were detected by TCC staining,and the phosphorylated NF-κB expression in rats brain was observed by immunohistochemistry and Western blot.Results: The TTC staining showed that different concentration of ICDP and BAY11-7082 could reduce the brain infarction volume significantly.There was no significant different effect among the ICDP-H group,ICDP-M group and inhibitor group,however,the effect in these three groups was more effective than that in the ICDP-M group.In addition,the results of immunohistochemistry indicated that phosphorylated NF-κB p65 expressed in brain tissue located mainly at the nucleus neuronal cells in the CA1 region of hippocampusin model rats,and the expression of phosphorylated NF-κB were significantly reduced inICDP groups and BAY11-7082 group.Conclusion: The ICDP can reduce brain infarct volume after ischemia reperfusion of rats.The neuralprotection mechanism of ICDP may relative toinhibits thehyperphosphorylation of NF-κB.

Injection coryadlis decumbens pers；Cerebral ischemia reperfusion；NF-κB；Neuroprotection

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.023

R743.3文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1187-05

徐祖才(1981年-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腦血管病及癲癇發病機制研究。

及指導教師：張駿(1964年-)，男，主任醫師，主要從事腦血管病機制研究，E-mail：zyzj8586@163.com。