胱硫醚-β-合成酶在腦缺血-再灌注大鼠模型中表達變化的研究

周曉璐　王國川　譚安超　劉杰麟　張　華

(貴州醫科大學附屬人民醫院輸血科，貴陽550002)

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胱硫醚-β-合成酶在腦缺血-再灌注大鼠模型中表達變化的研究

周曉璐王國川①譚安超劉杰麟②張華①

(貴州醫科大學附屬人民醫院輸血科，貴陽550002)

①貴州醫科大學附屬人民醫院檢驗科，貴陽550002。

②貴州醫科大學基礎醫學院免疫教研室，貴陽550004。

目的：觀察缺血-再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)大鼠模型腦組織中胱硫醚-β-合酶(Cystathionine β-synthase，CBS)表達的變化及意義。方法：采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。分別應用RT-PCR及Western blot法檢測SHAM組大鼠、I組大鼠以及IR組3 h、6 h、12 h和24 h大鼠腦內CBS mRNA和CBS蛋白的表達變化；采用ELISA法檢測大鼠血中同型半胱氨酸含量變化；采用CBS抑制劑羥胺抑制CBS活性后，Western blot法檢測氧化應激相關蛋白HO-1的表達，并用光鏡觀察腦組織的病理學變化。結果：IR大鼠腦組織CBS mRNA和蛋白表達水平顯著高于假手術組(P<0.01)，于再灌注12 h表達至峰值。和假手術組相比，血中同型半胱氨酸含量在再灌注12 h時水平最低(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001)。應用HA抑制CBS活性后，CBS及氧化應激相關蛋白HO-1表達顯著減少，光鏡下神經元損傷進一步加重。結論：缺血-再灌注后，腦組織中CBS表達上調可能對神經元產生保護效應。

腦卒中；缺血-再灌注；同型半胱氨酸；胱硫醚-β-合成酶；氧化應激

腦血管疾病尤其是腦卒中，是導致人類死亡的第三常見疾病，也是成人致殘的主要原因。其發病逐漸年輕化且發病率漸高，已成為家庭和社會的負擔。因此，對引發卒中的危險因素進行識別和干預，進而降低發病率和死亡率就顯得尤為重要[1]。近年來多項研究證實，高同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)血癥可作為腦卒中的獨立危險因素[2,3]。HCY是蛋氨酸脫甲基形成的含硫氫基的氨基酸；體內的HCY可被胱硫醚-β-合酶(Cystathionine β-synthase，CBS)催化后縮合為胱硫醚[4]。若CBS的含量或活性發生變化，會引起同型半胱氨酸血漿濃度異常。本研究動態觀察了腦缺血-再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)大鼠模型腦組織中CBS的變化，為探索其在IR腦損傷中的作用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑RIPA裂解液購自北京百泰克生物技術有限公司，Trizol RNA 提取試劑以及CBS和β-actin引物購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自美國KAPA公司，HCY ELISA試劑盒、CBS抗體和HO-1抗體購自美國Abcam公司，β-actin-HRP和HRP二抗購自美國Santa Cruz公司，羥胺(Hydroxyla mine，HA)購自美國Sigma公司。微孔板檢測儀(SpectraMax M2)購自加拿大Molecular Devices公司。

1.1.2實驗動物分組健康SD大鼠30只，體重250～280 g，鼠齡3～4個月，雌雄不拘，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。每個分組5只，隨機分成:(1)SHAM組：即假手術對照組，對大鼠進行10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后僅暴露頸總動脈不進行血管夾閉；(2)I組：即單純缺血組，對大鼠行麻醉手術后夾閉血管使缺血2 h；(3)IR組：即缺血再灌注組，夾閉血管使大鼠缺血2 h后松開血管夾使恢復血流，根據再灌注時間又分為再灌注3、6、12和24 h組；(4)HA組，缺血2 h再灌注6 h后，按照12.5 mg/kg的劑量腹腔注射CBS抑制劑HA[5]，再灌注至12 h。實驗結束時處死大鼠，眼眶取血及開顱取腦后進行相關指標的檢測。

1.2方法

1.2.1動物模型制備參照Belayev等[6]改良的Longa方法，選用頸外動脈插入線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。術中嚴密觀察，保持大鼠肛溫在36.5～37.5℃。

1.2.2神經功能評價經麻醉的大鼠清醒后，其神經功能評定參考Longa 5分制評分標準[7]。0分：無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向右側轉圈；3分：向右側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。

1.2.3腦組織中總mRNA的提取和CBS cDNA的RT-PCR不同時間點取的腦組織暫時放于-196℃液氮罐保存，樣本收齊后，腦組織總mRNA提取操作按照Trizol試劑說明書進行。按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將提取的mRNA逆轉錄為cDNA。β-actin引物序列為F:5′-ATGGATGACGATAT-CGCTGCG-3′和R:5′-TCGTCCCAGTTGGTGACA-ATG-3′；CBS引物序列為F:5′-GAACCAGACGGAGCAAACAG-3′和R:5′-TGTAGAGGACTTTGCAGACT-3′。用1%瓊脂糖凝膠對RT-PCR產物進行電泳分離后凝膠成像照相。用Bandscan5.0凝膠圖像處理軟件進行灰度分析，CBS mRNA相對表達量=CBS擴增產物條帶灰度值/β-actin擴增產物條帶灰度值。

1.2.4蛋白提取和Western blot檢測用RIPA裂解液裂解組織收取蛋白上清液。定量30 μg總蛋白，并用10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉法將目的蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜。用含有5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h后孵育一抗，4℃搖床輕搖過夜；用TBST洗膜3次后，室溫孵育辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記二抗1 h。ECL化學發光后，測定反應條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算各種蛋白的相對表達量。

1.2.5ELISA驗證血清HCY的表達按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血中HCY的含量。1.2.6腦組織學檢查大鼠腦組織用10 %中性甲醛固定后進行石蠟包埋，制成5 μm厚切片行HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

2　結果

2.1大鼠神經功能評定結果IR組大鼠麻醉清醒后均出現明顯的眼球下陷，肢體無力等癥狀，神經功能評分為平均為(3.40±0.55)分，且肢體癱瘓癥狀以缺血2 h再灌注24 h最明顯；I組2只不能伸展前肢，2只出現向左側劃圈，1只出現向左傾倒，神經功能評分為(1.80±0.84)分；HA組出現1只不能伸展前肢，1只出現向左側劃圈，3只出現向左傾倒，神經功能評分為(2.40±0.89)分；而假手術組動物則無明顯的神經功能障礙。

2.2腦組織中CBS mRNA表達的變化CBS mRNA在SHAM組和I組大鼠腦組織中表達無差異(P>0.05)。與SHAM組相比，腦組織中的CBS mRNA在缺血-再灌注3 h后開始上調(P<0.01)，12 h表達至峰值(P<0.01)，見圖1。

2.3腦組織中CBS蛋白表達的變化Western blot實驗結果顯示，CBS蛋白在SHAM組和I組大鼠腦組織中表達無差異(P>0.05)。與SHAM組相比，腦組織中的CBS蛋白在缺血-再灌注6 h后開始上調(P<0.01)，12 h表達至峰值(P<0.01)，見圖2。應用HA抑制CBS，至再灌注12 h時，CBS的表達量相

圖1　缺血-再灌注各時間點大鼠腦組織中CBS mRNA的表達Fig.1　Expression of CBS mRNA in rat brain during cerebral ischemia-reperfusionNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2　缺血-再灌注各時間點大鼠腦組織中CBS 蛋白的表達Fig.2　Expression of CBS protein in rat brain during cerebral ischemia-reperfusionNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖3　各組大鼠腦組織中CBS和HO-1的表達Fig.3　Expression of CBS and HO-1 in rat brain between different groupsNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4　各組大鼠大腦皮質的組織形態學改變(HE染色，×400)Fig.4　Morphological changes of cerebral cortex in different groups(HE staining,×400)

表1　各組大鼠缺血-再灌注時血中HCY含量的變化Tab.1　Concentration of plasma HCY in rat during cerebral ischemia-reperfusion

較于IR組顯著下調，同時觀察到HO-1發生協同性變化，差異有統計學意義，見圖3。

2.4血HCY含量的變化SHAM組和I組大鼠血中HCY含量沒有統計學差異。與SHAM組相比，缺血-再灌注12 h后血中HCY顯著下調(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001)；應用HA抑制CBS活性，血中HCY含量則無明顯改變(P>0.05)，見表1。

2.5腦組織形態學的變化光鏡下可見SHAM組腦組織結構清晰，未發現病理性改變。I組腦組織病理損傷輕，少量神經元胞核、胞體增大，著色變淺。與SHAM組相比，IR組大腦皮質部分神經病理損傷進一步加重，細胞周圍出現水腫裂隙。應用HA抑制CBS活性，光鏡下可見HA組較IR組病變減輕，固縮的神經元數目減少，見圖4。

3　討論

根據世界各國死亡報告統計表明，全球每年死于腦卒中者約59.8%為缺血性腦卒中[8]。持續腦缺血可引起神經細胞不可逆的損傷從而導致腦功能的降低或損壞，而短暫性腦缺血后，機體會做出防御反應，主動產生神經保護作用相關因子或大分子蛋白，這種內在對抗機制使機體能耐受一定程度的缺血損傷[9]。本研究運用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，觀察腦缺血-再灌注腦組織中CBS含量的動態變化。研究發現，缺血-再灌注后CBS水平呈時間依賴性增加，在12 h時可達高峰，相反血中HCY水平則降至最低，表明缺血-再灌注發生時，體內CBS和HCY可能參與了疾病過程；對IR大鼠使用CBS抑制劑HA后，CBS表達量減少，HCY水平較未使用HA大鼠有顯著升高，且HO-1的表達則減少，提示CBS在腦卒中的發生發展中發揮了舉足輕重的作用，細胞氧化應激亦可能參與其中。

IR發生后，腦組織內誘導產生大量的誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及其產物NO，同時血液中超氧陰離子等各種自由基含量也急劇上升，NO與超氧陰離子快速結合生成氧化性更強的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，使腦內的自由基反應進一步增強，損傷加重[10]。組織細胞可產生多種抗氧化酶抵御氧化性損傷，其中血紅素氧合酶(Hemeoxygenase，HO)亞型HO-1是細胞對抗應激反應和抗氧化損傷的重要組成部分。Robert等[11]研究指出，由CBS缺乏引起的高半胱氨酸血癥和肝臟細胞的氧化應激相關。Han等[12]則進一步證實，在熱驚厥小鼠模型中使用CBS抑制劑HA后，HO-1的表達下調，細胞抗氧化損傷能力減弱。此外，王瑜玲等[13]應用大鼠肢體缺血-再灌注模型觀察大腦皮層和海馬區CBS表達量的變化，發現12 h時CBS的表達量最高，其調控的具有神經元保護作用的硫化氫(H2S)水平相應增高；當抑制CBS的表達時，光鏡下可見神經元的病變進一步加重，證實CBS對神經元有一定的保護效應。CBS作為同型半胱氨酸代謝的限速酶，其含量和活性的變化直接決定了血液中HCY的水平。Baumbach等[14]通過檢測CBS基因缺陷鼠中HCY的含量，發現相比于野生型CBS+/+鼠，CBS+/-鼠中HCY的水平升高了近60%，同時觀察到小鼠大腦血管壁顯著增厚，提示CBS及其調控的HCY在血管疾病的發病中發揮了重要作用。

1969年McCully[15]首次提出高同型半胱氨酸與心腦血管疾病存在關聯，此后，大量研究表明高同型半胱氨酸血癥是腦卒中的獨立危險因素。HCY是一種含巰基的氨基酸，是甲硫氨酸代謝的中間產物，在正常情況下HCY維持在較低水平(5～15 mmol/L)，其生成和代謝保持動態平衡[16]。HCY每升高50 μmol/L，腦血管病的風險將增加50%。CBS參與同型半胱氨酸的代謝，在CBS的催化下，絲氨酸與同型半胱氨酸結合使之清除。CBS水平明顯降低可引起高同型半胱氨酸血癥，后者進一步促進動脈硬化的形成。高HCY致腦卒中的發病機制可能是多方面的，HCY可促使過氧化氫和氧自由基生成，對血管內皮細胞造成損傷和毒性作用；其次，它還可以促進動脈平滑肌細胞的增生；通過加速低密度脂蛋白氧化、增加泡沫細胞的形成和激活血小板黏附、聚集，亦可導致脈粥樣硬化和梗死[17]。

本研究初步證實了CBS表達上調在缺血-再灌注損傷中對神經元有保護作用，我們將進一步研究CBS在IR腦損傷過程中確切的抗氧化應激機制。

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[收稿2015-11-16修回2016-01-27]

(編輯張曉舟)

Dynamic change of cystathionine β-synthase during cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats

ZHOU Xiao-Lu,WANG Guo-Chuan,TAN An-Chao,LIU Jie-Lin,ZHANG Hua.Department of Hematology,the Affiliated People′s Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550002,China

Objective:To observe the dynamic change of cystathionine β-synthase during cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats.Methods: The ischemic model was established with line embolism to block the middle cerebral artery.The reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot assay were used to assess the expression of cystathionine β-synthase(CBS) in SHAM group,I group,and IR group.ELISA assay was performed to detected the homocysteine(HCY) level in plasma.After treating with the inhibitor of cystathionine β-synthase called hydroxyla mine(HA),the expression of hemeoxygenase 1(HO-1) and the pathologic change of the brain was evaluated.Results: As compared to sham group,the expression of CBS was significantly up-regulated in ischemia-reperfusion group at 12 h post-reperfusion.Meanwhile,it existed the lowest level of HCY at 12 h post-reperfusion,comparing to sham grouzp(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001).When inhibited the activity of CBS via using HA,the down-regulation of HO-1 protein and further damage in neuron were observed.Conclusion: Cystathionine β-synthase serves as an protective factor during cerebral ischemia-reperfusion.

Stroke;Ischemia-reperfusion;Homocysteine;Cystathionine β-synthase;Oxidative stress

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.012

R743.31文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1141-04

周曉璐(1984年-)，女，碩士，主管技師，主要從事免疫學、輸血檢驗方面的研究，E-mail：zhouxiaolu293@163. com。

及指導教師：劉杰麟(1963年-)，男，博士，教授，主要從事基礎免疫學方面的研究，E-mail：ljll282@163.com。

張華(1970年-)，女，博士，主任技師，主要從事臨床免疫學方面的研究，E-mail：zhanghua937@163.com。