3-甲基腺嘌呤對喜樹堿誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響①

王曉娜　任來峰　趙安江　楊萬霞　任云青

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽032200)

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3-甲基腺嘌呤對喜樹堿誘導(dǎo)的宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響①

王曉娜任來峰趙安江楊萬霞任云青

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽032200)

①本文為山西省自然科學(xué)基金(No.2014021037-9)、山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院博士啟動基金(No.1301)和山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科研項目基金(No.1422)資助的課題。

目的：本研究探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對喜樹堿(Camptothecin,CPT)誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡的影響。方法：用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT方法)檢測CPT對Hela細(xì)胞作用的最佳藥物濃度和時間，以及不同藥物對Hela細(xì)胞增殖活性的影響；用免疫印跡及免疫熒光檢測不同藥物作用于Hela細(xì)胞后，Hela細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62及凋亡相關(guān)蛋白的變化；DAPI核染色觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果：CPT作用于Hela細(xì)胞后，Hela細(xì)胞增殖活性明顯下降，并且可誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象的發(fā)生。CPT和3-MA聯(lián)合作用較單獨CPT作用Hela細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞自噬水平下降，凋亡率明顯升高。結(jié)論：CPT在誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的同時可誘導(dǎo)自噬，通過3-MA抑制自噬可增強(qiáng)Hela細(xì)胞對CPT作用的敏感性。

3-甲基腺嘌呤；喜樹堿；自噬；凋亡；Hela細(xì)胞

宮頸癌是全世界發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。化療在中晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者治療中發(fā)揮重要作用，然而腫瘤耐藥已經(jīng)成為化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2]。因此，探討如何抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性的發(fā)生或增強(qiáng)化療藥物的抗癌活性成為臨床治療腫瘤的重要課題。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種化療藥物可引起腫瘤細(xì)胞的自噬反應(yīng)，自噬在腫瘤化療中可能發(fā)揮促凋亡或促生長作用，可能與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)[3]。喜樹堿(Camptothecin,CPT)是以拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ為作用靶點的抗腫瘤藥物，臨床上已被用于卵巢癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌及腦瘤的治療[4]。本實驗以宮頸癌Hela細(xì)胞為細(xì)胞模型，通過將自噬抑制劑3-MA與CPT聯(lián)合使用，觀察抑制自噬對CPT誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的影響，探討自噬與CPT化療作用間的關(guān)系，為宮頸癌治療提供新的策略。

1　材料與方法

1.1實驗材料人宮頸癌Hela細(xì)胞株和喜樹堿(Sigma)由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院發(fā)育與干細(xì)胞研究所劉聰教授惠贈；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；3-MA及氯喹(CQ)購自Selleck公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶公司；抗α-tubulin 抗體、HRP標(biāo)記的抗鼠和抗兔二抗、Cyc3標(biāo)記的抗兔二抗均購于Sigma公司；抗LC3B、caspase-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；抗p62及PARP抗體購自Abcam公司；細(xì)胞核染料DAPI購自Vector公司；ECL化學(xué)發(fā)光劑購自Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板購自Corning公司；酶標(biāo)儀(Eon)購自BioTek公司；熒光顯微鏡(DM4000)購自Leica公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代宮頸癌Hela細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2日更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至70%～80%匯合度時，用0.25%胰酶進(jìn)行消化處理。

1.2.2MTT細(xì)胞增殖活性的檢測收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104～7×104個/ml，接種于96孔板，每孔100 μl；待細(xì)胞完全貼壁后，加入作用藥物，對照組加DMSO，每組設(shè)立5個復(fù)孔；放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)8、32、56 h，終止培養(yǎng)前4 h加入10 μl MTT溶液(濃度為5.0 mg/ml)；終止培養(yǎng)后，輕輕吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解，在570 nm測量各孔的吸光度值，計算各孔平均OD值，以對照組細(xì)胞活性為100%，計算各孔的細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。檢測不同濃度CPT對Hela細(xì)胞增殖活性的影響，CTP濃度分別設(shè)為0.5、1.0、2.0 μmol/L；為檢測3-MA與CPT聯(lián)合對Hela細(xì)胞增殖活性的影響，將細(xì)胞分為4組，分別為對照組(DMSO)、CPT組(1.0 μmol/L)、3-MA(1.0 mmol/L)、CPT(1.0 μmol/L)+3-MA(1.0 mmol/L)聯(lián)合組。

1.2.3免疫熒光檢測將對數(shù)期Hela細(xì)胞用胰酶消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度，將Hela細(xì)胞接種于小載玻片上，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入對應(yīng)藥物，培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，加入4%PFA固定10 min或冰甲醇-20℃固定15 min(用于LC3染色),PBS洗滌一次；加入0.3%TritonX-100通透10 min,PBS洗滌一次；免疫熒光封閉液(0.1%TritonX-100+1%BSA)室溫封閉30 min;吸棄封閉液，加入抗LC3B、p62一抗，37℃、30 min，PBS洗滌3次；加入Cyc3標(biāo)記的抗兔二抗(1∶200)37℃，濕暗盒30 min，PBS洗滌3次；DAPI進(jìn)行封片，固定，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4免疫印跡分析取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，消化離心，鋪6孔板，細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的藥物，藥物分組同熒光染色分組，作用36 h,收集細(xì)胞，加入(強(qiáng))RIPA裂解液，在冰上裂解15～30 min后，4℃,12 000 r/min,離心10 min，取上清用BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測定，調(diào)整蛋白濃度，加入4×loading Buffer煮沸變性10 min得到蛋白樣品。上樣，用12%SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗LC3B、p62、PARP、caspase-2、α-tubulin，4℃過夜，TBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗、抗鼠二抗，室溫1 h,TBST洗滌3次，每次10 min,加入ECL底物發(fā)光，在暗室進(jìn)行曝光，顯影、定影，觀察結(jié)果。

1.2.5細(xì)胞凋亡分析按1.2.3方法收集細(xì)胞，用DAPI染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察，參考文獻(xiàn)[5]的方法計數(shù)正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1CPT對宮頸癌Hela細(xì)胞的毒性作用CPT具有抑制Hela細(xì)胞的增殖活性。選用不同濃度CPT(0.5、1.0、2.0 μmol/L)分別作用Hela細(xì)胞12、36、60 h,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)見圖1A，用MTT檢測CPT對Hela細(xì)胞增殖活性影響。CPT對Hela細(xì)胞抑制率隨藥物濃度增加及時間延長，呈劑量和時間依賴性(圖1B)。

2.2CPT誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬的產(chǎn)生CPT作用于Hela細(xì)胞后，Hela細(xì)胞內(nèi)LC3的熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高(圖2A、C)；同時p62的熒光強(qiáng)度及p62蛋白表達(dá)水平降低(圖2B、圖4)；氯喹(CQ)與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞較單獨CPT或CQ作用，LC3的熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高(圖2A、C)，以上結(jié)果表明CPT可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞產(chǎn)生自噬。

圖1　CPT 對Hela 細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1　Effect of CPT on Hela cell proliferation activityNote: A.Morphological changes of Hela cells after treated with different concentrations of CPT for 36 hours(×20)；B.Cell inhibition rate of Hela cells after treated with CPT.

2.33-MA聯(lián)合CPT明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖單獨使用1 mmol/L 3-MA作用于Hela細(xì)胞，Hela細(xì)胞的增殖活性無顯著變化(P>0.05)；3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞較單獨3-MA或CPT作用于Hela細(xì)胞(36 h,60 h)，Hela細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P<0.05，圖3A、B)，以上提示3-MA抑制自噬可顯著增強(qiáng)CPT對Hela細(xì)胞的毒性作用。

2.43-MA增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡不同藥物作用于Hela細(xì)胞后，Hela細(xì)胞的凋亡率不同。單獨使用3-MA或CPT作用于Hela細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為4.03%±0.70%、8.23%±2.00%，與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。3-MA與CPT聯(lián)合作用Hela細(xì)胞(凋亡率為29.0%±5.10%)與單獨使用CPT或3-MA比較，細(xì)胞凋亡率明顯增高(圖3C、D)，提示3-MA增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡。

2.53-MA抑制自噬增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)CPT作用于Hela 細(xì)胞后，Hela 細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白水平增加，p62蛋白水平降低，提示CPT可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬，同前面結(jié)果一致。單獨3-MA或3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela 細(xì)胞與單獨CPT作用相比，LC3Ⅱ蛋白水平降低，p62表達(dá)增加(圖4)，說明加入3-MA可抑制細(xì)胞自噬。

CPT作用于Hela細(xì)胞后，總caspase-2蛋白水平降低，cleavage-PARP水平升高，提示CPT作用Hela細(xì)胞后可誘導(dǎo)凋亡信號的活化。3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞較單獨CPT作用，cleavage-PARP水平明顯升高，總caspase-2水平降低(圖4)，結(jié)果提示3-MA抑制Hela細(xì)胞自噬可顯著增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。

圖2　CPT 誘導(dǎo)的Hela 細(xì)胞內(nèi)LC3及p62的變化Fig.2　Changes of LC3 and p62 CPT-induced Hela cellsNote: A.Fluorescence images of LC3B expression in Hela cells(×40);B.Fluorescence images of p62 expression in Hela cells(×20);C.The expressions of LC3Ⅰand LC3Ⅱprotein in Hela cells.

圖3　3-MA聯(lián)合CPT對CPT誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響Fig.3　Effect of 3-MA in combination with CPT on CPT-induced cell deathNote: A.Morphological changes of Hela cells after treated with different drugs for 36 hours(×20)；B.The proliferation activity of Hela cells treated with different drugs at different time points；C.Morphological changes of Hela cells with nuclear staining after treated with different drugs for 16 hours(×20)；D.Hela cell apoptosis rates.

圖4　不同藥物作用的Hela細(xì)胞LC3、p62、PARP、caspase-2、α-tubulin蛋白表達(dá)Fig.4　Protein expressions of LC3,p62,PARP,caspase-2,and α-tubulin in Hela cells treated with different drugs

3　討論

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第4位常見的惡性腫瘤。約85%宮頸癌發(fā)生于發(fā)展中國家，并且在這些國家宮頸癌居癌癥死因的首位[6]。化療在宮頸癌高危病例和晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的治療中是必不可缺的重要手段，然而宮頸癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重地影響了化療藥物的治療效果[2]。因此，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的新方法及靶向治療將為宮頸癌化療耐藥的處理提供新的視角。喜樹堿(CPT)是一種天然五環(huán)的喹啉生物堿，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ導(dǎo)致DNA雙鏈在復(fù)制時斷裂，從而引起細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用。CPT及衍生物被用于多種腫瘤的治療，包括卵巢癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、腺癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤[4,14]。本實驗以宮頸癌Hela細(xì)胞為細(xì)胞模型，用不同濃度CPT處理Hela細(xì)胞，MTT檢測結(jié)果顯示CPT對Hela細(xì)胞的毒性作用是時間和劑量依賴性的。

自噬是真核生物普遍存在的現(xiàn)象。在生理條件下，細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬活性能清除細(xì)胞內(nèi)老化、受損的生物大分子和細(xì)胞器等，以維持正常的細(xì)胞生物學(xué)功能，抑制細(xì)胞發(fā)生癌變。但在饑餓、能量缺乏、放化療等代謝應(yīng)激狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞自噬水平升高，通過自噬降解老化的、受損的生物大分子和細(xì)胞器等，能獲得能量來源和重建的物質(zhì)而有助于腫瘤細(xì)胞存活。自噬作為細(xì)胞對代謝應(yīng)激壓力(低氧、輻射、營養(yǎng)缺乏等)的適應(yīng)性反應(yīng)，可能與腫瘤耐藥有關(guān)[7,8]，因此，適當(dāng)調(diào)節(jié)自噬，如抑制腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性自噬，可為腫瘤治療提供一種新的方案[9,10]。3-MA屬特異磷酸肌醇3磷酸激酶(PI3K)抑制劑，在自噬過程的早期階段通過抑制PI3K來阻斷自噬，PI3K的活性對于自噬體形成是必需的[11]。通過加入自噬抑制劑、敲除自噬相關(guān)基因抑制自噬可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對多種細(xì)胞毒性藥物的敏感性。有研究報道3-MA可加強(qiáng)奧沙利鉑對結(jié)直腸癌的療效[12]；在人鼻咽癌及食管癌中，3-MA抑制自噬可增強(qiáng)癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加體內(nèi)外藥物及放療的效果[11,13]。因此，可見自噬對腫瘤細(xì)胞的生長具有保護(hù)作用，抑制自噬可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。但也有與上述報道不一致的結(jié)果，如Hollomon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除自噬相關(guān)基因Atg5抑制自噬可減弱CPT誘導(dǎo)的骨肉瘤DLM8細(xì)胞的死亡作用；An[15]發(fā)現(xiàn)通過3-MA/敲除Beclin-1基因抑制自噬顯著減弱Mimulone(白花泡桐葉成分)誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞的凋亡，這與在肺癌A549細(xì)胞中，通過抑制腫瘤細(xì)胞的自噬增強(qiáng)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡相反[16]。因此，腫瘤細(xì)胞的自噬作用對腫瘤細(xì)胞的凋亡是促進(jìn)作用還是抑制作用，可能依腫瘤細(xì)胞系及使用藥物不同而不同。本實驗中當(dāng)3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞后，Hela細(xì)胞的增殖活性明顯下降和凋亡增加，說明3-MA抑制自噬可增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡。

本實驗發(fā)現(xiàn)CPT在誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的同時可誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象的發(fā)生。哺乳動物細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)有三種，包括LC3A、LC3B和LC3C，它們在自噬過程存在相關(guān)的翻譯修飾。LC3蛋白首先在合成后立即在羧基端被Atg4剪切，產(chǎn)生胞漿型LC3-Ⅰ；在自噬過程中，LC3-Ⅰ會被泛素樣體系脂化，產(chǎn)生LC3-Ⅱ，并定位在自噬小體中，因此LC3-Ⅱ可作為反映自噬體形成的指標(biāo)，但LC3-Ⅱ檢測須同氯喹/E64d抑制“自噬潮”相結(jié)合。p62為自噬活化過程中的一個調(diào)節(jié)分子，與多泛素化蛋白相互作用促進(jìn)其聚合并靶向于自噬體，在自噬溶酶體中降解[17,18]。本實驗選用LC3B、p62作為評價自噬的指標(biāo)，結(jié)果顯示CPT作用于Hela細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬體形成，Hela細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，p62則降低；CQ與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞，Hela細(xì)胞內(nèi)LC3熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高。

采用Western blot分析了3-MA抑制自噬對CPT誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，加入3-MA可抑制Hela細(xì)胞自噬，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)降低，p62表達(dá)增加；3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞可增強(qiáng)凋亡蛋白的表達(dá)，cleavage-PARP蛋白水平顯著升高和總caspase-2蛋白的明顯降低。

總之，CPT可以誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生自噬，且自噬影響CPT對Hela細(xì)胞的增殖活性。利用3-MA抑制自噬可顯著增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，3-MA聯(lián)合CPT可為臨床治療宮頸癌提供一種新的策略。

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[收稿2016-03-28修回2016-05-11]

(編輯倪鵬)

·啟事·

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《中國免疫學(xué)雜志》編輯部

Effect of 3-MA on camptothecin-induced cervical cancer Hela cell apoptosis

WANG Xiao-Na,REN Lai-Feng,ZHAO An-Jiang,YANG Wan-Xia,REN Yun-Qing.Fenyang College of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China

Objective:To explore the effect of autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA) on camptothecin(CPT)-induced Hela cell apoptosis.Methods: MTT assays were carried out to determine the optimal concentration and time of CPT on Hela cells and the effect of different drugs on Hela cell proliferation activity.After Hela cells were treated with different drugs,the changes of autophagy marker protein(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),p62 and apoptosis-related protein were detected using Western blot and immunofluorescence(IF).DAPI(nuclear) staining was used to observe cell apoptosis rate.Results: In CPC-treated Hela cells,Hela cell proliferation activity declined dramatically,and autophagy could be induced to occur.Compared with CPT group,the cell proliferation activity was lower in CPT combined with 3-MA group,the level of autophagy decreased,but the apoptosis rate significantly increased.Conclusion: CPT can induce autophagy while inducing Hela cell death.Hela cells chemosensitivity to CPT treatment can be enhanced by 3-MA inhibiting autophagy.

3-methyladenine;Camptothecin;Autophagy;Apoptosis;Hela cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.009

R737.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1128-05

王曉娜(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事宮頸癌治療機(jī)制方面的研究，E-mail：18135845975@163.com。

及指導(dǎo)教師：任云青(1964年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生殖免疫、腫瘤免疫方面研究,E-mail:15535875200@163.com。