小鼠γδ T細(xì)胞亞群在不同組織器官的分布特性及在感染后的變化①

胡　淵　李　燕　關(guān)　妘　張　彩

(山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥物學(xué)研究所,濟(jì)南250012)

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小鼠γδ T細(xì)胞亞群在不同組織器官的分布特性及在感染后的變化①

胡淵李燕關(guān)妘張彩

(山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥物學(xué)研究所,濟(jì)南250012)

①本文受?chē)?guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)項(xiàng)目(2013CB944901)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273220, 81472646, 91442114)資助。

目的：關(guān)注不同γδ T細(xì)胞亞群在各組織器官的分布特點(diǎn)及在鼠傷寒沙門(mén)氏菌腸道感染中的變化，為探討γδ T細(xì)胞組織學(xué)分布的生理學(xué)意義和在感染性疾病中的作用提供依據(jù)和新的思路。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)與PCR技術(shù)檢測(cè)胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、皮膚以及小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中γδ T細(xì)胞及其不同亞群的比例；通過(guò)PMA與離子霉素體外刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組織γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ與IL-17a的差異；通過(guò)灌胃建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌腸道感染模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟與小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中不同γδ T細(xì)胞亞群比例的變化。結(jié)果：γδ T細(xì)胞富含于小腸上皮內(nèi)、皮膚與肝臟中，而在胸腺、脾臟與淋巴結(jié)中比例較低。不同亞群在各組織器官中的分布存在較大差異，皮膚主要存在Vγ5+γδ T細(xì)胞亞群，小腸中主要存在Vγ1+、Vγ4+與Vγ7+γδ T細(xì)胞亞群。肝臟γδ T細(xì)胞主要分泌IL-17a，而小腸上皮內(nèi)γδ T細(xì)胞主要分泌IFN-γ。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌腸道感染時(shí)，小腸上皮內(nèi)γδ T細(xì)胞的比例明顯升高，其中Vγ1+γδ T細(xì)胞比例升高更為顯著；肝臟總γδ T細(xì)胞比例無(wú)顯著變化，但Vγ1+γδ T細(xì)胞比例降低，Vγ4+γδ T細(xì)胞比例明顯升高。結(jié)論：γδ T細(xì)胞富含于小腸、皮膚與肝臟中，且其不同亞群具有組織分布特異性。不同組織的γδ T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力存在較大差異。鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染時(shí)，小腸與肝臟γδ T細(xì)胞亞群的分布變化也存在較大差異。

γδ T細(xì)胞；組織分布；鼠傷寒沙門(mén)氏菌

T細(xì)胞在胸腺發(fā)育的早期發(fā)生TCR基因重排，形成具有巨大多樣性特征的TCR庫(kù)。根據(jù)T淋巴細(xì)胞表達(dá)TCR的不同，可以將T淋巴細(xì)胞分成兩類(lèi)，即表達(dá)αβ TCR的T細(xì)胞(αβ T細(xì)胞)和表達(dá)γδ TCR的T細(xì)胞(γδ T細(xì)胞)。γδ T細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞的重要組成之一，在免疫防御、免疫監(jiān)視及某些疾病(例如人類(lèi)獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤和自身免疫性疾病等)的進(jìn)程中扮演重要角色。多項(xiàng)研究表明，γδ T細(xì)胞在腸黏膜屏障抵抗病原菌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在感染數(shù)小時(shí)內(nèi)，即可快速、準(zhǔn)確地遷移至受感染部位，殺傷受感染的上皮細(xì)胞，抑制病原菌的侵襲[1,2]。

γδ T細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞群體，根據(jù)其TCR γ或δ鏈?zhǔn)褂玫牟煌瑢⑵浞譃槎鄠€(gè)亞群。從發(fā)現(xiàn)γδ T細(xì)胞至今，有多個(gè)命名系統(tǒng)被應(yīng)用。這里我們采用Heilig與Tonegawa命名法則[3]對(duì)小鼠γδ T細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。與αβ T細(xì)胞類(lèi)似，γδ T細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中需要進(jìn)行TCR基因重排，編碼TCRγ鏈的基因座上含有V、J、C基因片段。早期研究發(fā)現(xiàn)小鼠TCRγ基因包含7個(gè)V基因片段，但由于與V3基因片段進(jìn)行重排的J3與C3基因片段是假基因[4]，故不存在Vγ3Jγ3Cγ3鏈。因此，根據(jù)γ鏈?zhǔn)褂玫牟煌蓪⑿∈螃忙?T細(xì)胞分為6個(gè)亞群，分別為Vγ1+、Vγ2+、Vγ4+、Vγ5+、Vγ6+和Vγ7+γδ T亞群。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，Vγ1+γδ T細(xì)胞主要發(fā)揮抑炎作用[5,6]，而Vγ4+γδ T細(xì)胞主要發(fā)揮促炎作用[5]，Vγ5+γδ T細(xì)胞主要分布于皮膚，對(duì)于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)起重要作用[7]；Vγ7+γδ T細(xì)胞主要分布于小腸，對(duì)于腸道穩(wěn)態(tài)的維持、免疫監(jiān)視與病原菌的清除發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。目前，針對(duì)γδ T細(xì)胞發(fā)育與功能的研究相對(duì)較多，但是對(duì)于不同γδ T細(xì)胞亞群的組織分布特性未見(jiàn)詳細(xì)系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此本研究主要關(guān)注不同γδ T細(xì)胞亞群在各組織器官的分布特點(diǎn)及在鼠傷寒沙門(mén)氏菌腸道感染后的變化，以期為γδ T細(xì)胞的組織分布及在感染等相關(guān)疾病中的作用提供依據(jù)和新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1菌株鼠傷寒沙門(mén)氏菌，購(gòu)自ATCC，編號(hào)14028。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3試劑FITC標(biāo)記的γδ TCR抗體、Vγ1抗體、Vγ4抗體和Vγ5抗體，PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD3e抗體，APC標(biāo)記的γδ TCR抗體，均購(gòu)自Biolegend公司。內(nèi)標(biāo)用固定穿膜試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。離子霉素和佛波酯(Pbolmyristate acetate，PMA)購(gòu)自Sigma公司。布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)購(gòu)自碧云天公司。Trizol試劑和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogene公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自全式金公司。膠原酶Ⅱ購(gòu)自Gibco公司。Percoll液購(gòu)自GE Healthcare公司。分離小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞所需的消化液配方為1 000 ml三蒸水中加入8 g NaCl、0.4 g KCl、0.152 g Na2HPO4·12H2O、0.06 g KH2PO4、0.175 g NaHCO3、1 g葡萄糖、1 mmol/L EDTA及1 mmol/L DTT。

1.1.4儀器流式細(xì)胞儀FACS Calibar，美國(guó)BD公司；普通PCR儀，Bio-Rad公司；離心機(jī)Centrifuge 5810R，Eppendorf公司；凝膠成像儀，Alphalmager公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肝臟單個(gè)核細(xì)胞的分離摘眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，剪下肝臟，用PBS清洗干凈后剪碎肝組織，經(jīng)200目金屬篩網(wǎng)研磨過(guò)濾后，700 r/min離心1 min，收集上層液體，棄沉淀。再1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。經(jīng)40% Percoll液2 500 r/min密度梯度離心25 min后，留沉淀，棄上層液體。細(xì)胞沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，再經(jīng)PBS洗滌后，即得肝臟單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離處死小鼠，取出小腸，除去黏連的結(jié)締組織，沖洗腸腔并將小腸外翻。將小腸剪成約1 cm的小段，放入10 ml消化液中，37 ℃，180 r/min振蕩40～45 min。振蕩完畢后，用尼龍柱和紗布進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。用3 ml 40% Percoll液懸起細(xì)胞沉淀，將其疊加到2 ml 70% Percoll液上，1 800 r/min梯度密度離心20 min后，吸取白色云霧狀中間層細(xì)胞，再經(jīng)PBS洗滌后，即得小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。

1.2.3皮膚淋巴細(xì)胞的分離剪取腹部及背部皮膚組織，剪去鼠毛及脂肪組織。將皮膚剪成小塊，放入5 ml 含2 mg/ml膠原酶Ⅰ的PBS中，37℃，110 r/min振蕩2 h。經(jīng)200目金屬篩網(wǎng)過(guò)濾后，再1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。用4 ml 40% Percoll液懸起細(xì)胞沉淀，將其疊加到4 ml 70% Percoll液上，2 200 r/min梯度密度離心25 min后，吸取白色云霧狀中間層細(xì)胞，再經(jīng)PBS洗滌后，即得皮膚淋巴細(xì)胞。

1.2.4脾臟、胸腺與淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞的分離摘眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，剪下脾臟、胸腺與腹股溝淋巴結(jié)，用PBS清洗干凈后剪碎，分別經(jīng)200目金屬篩網(wǎng)研磨過(guò)濾后，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，即得胸腺和淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞。脾臟細(xì)胞再經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解，PBS洗滌后，即得脾臟單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志將提取的細(xì)胞加入大鼠血清進(jìn)行封閉，4℃，30 min。分別加入相應(yīng)稀釋的熒光抗體，4℃避光染色30 min。加入PBS離心洗滌，除去未結(jié)合的抗體，加入適量PBS懸起細(xì)胞沉淀，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)將細(xì)胞沉淀重懸于含10%新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，接種于12孔板內(nèi)，加入終濃度為30 ng/ml PMA與1 μg/ml離子霉素，37℃ 5%CO2孵育1 h后加入終濃度為10 ng/ml 的BFA，繼續(xù)孵育3 h。收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，加入大鼠血清封閉，加入外標(biāo)抗體染色，避光，室溫染色1 h。胞內(nèi)固定穿膜按BD公司試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟執(zhí)行，加入內(nèi)標(biāo)抗體，經(jīng)洗滌后，懸起細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7半定量RT-PCR檢測(cè)不同Vγ鏈的表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按M-MLV試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃ 30s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，38個(gè)循環(huán)后，72℃ 10 min，擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由于TCRγ鏈轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)發(fā)生TCR基因重排，通常6個(gè)V基因與J或D基因的重排組合是Vγ1Jγ4Cγ4、Vγ2Jγ2Cγ2、Vγ4Jγ1Cγ1、Vγ5Jγ1Cγ1、Vγ6Jγ1Cγ1、Vγ7Jγ1Cγ1[8]。PCR檢測(cè)不同TCRγ鏈的引物組合策略見(jiàn)表1，引物序列見(jiàn)表2。

1.2.8鼠傷寒感染模型的建立采用灌胃方式建立鼠傷寒腸道感染模型[9]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌的灌胃劑量是1×105CFU/只，空白對(duì)照組給予相同體積的LB培養(yǎng)基(0.2 ml)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用方差分析檢驗(yàn)各組均數(shù)間差異的顯著性，組間比較選用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有顯著性。

2　結(jié)果

2.1不同組織器官γδ T細(xì)胞的比例檢測(cè)我們首先用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了成年小鼠胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、皮膚及小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中γδ T細(xì)胞的比例。如圖1所示，胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、皮膚及小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中γδ T細(xì)胞的比例分別是0.18%±0.06%、0.67%±0.15%、0.63%±0.08%、1.81%±0.33%、9.36%±6.01%和34.10%±12.94%。肝臟、皮膚與小腸中γδ T細(xì)胞的比例明顯高于其他免疫器官，差異有顯著性。

表1　引物組合策略Tab.1　Primer combination strategy

2.2不同γδ T細(xì)胞亞群的組織分布我們利用流式細(xì)胞術(shù)與PCR技術(shù)分別檢測(cè)了胸腺、脾臟、肝臟、皮膚與小腸中γδ T細(xì)胞亞群的分布。由于只能買(mǎi)到商品化抗Vγ1、Vγ4與Vγ5的單抗，所以我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了這三個(gè)亞群在不同器官的分布。同時(shí)結(jié)合PCR技術(shù)，檢測(cè)了各器官中Vγ1、Vγ2、Vγ4、Vγ5、Vγ6與Vγ7的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，分布于小腸的γδ T細(xì)胞主要以Vγ1和Vγ4亞群為主，皮膚組織的γδ T細(xì)胞以Vγ5亞群為主(圖2A)。PCR的結(jié)果顯示，小腸IEL中γδ T細(xì)胞除Vγ1和Vγ4表達(dá)較高(與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致)外，Vγ7表達(dá)水平很高(與文獻(xiàn)報(bào)道一致)，胸腺與脾臟只表達(dá)Vγ1、Vγ2和Vγ4，而肝臟Vγ1～Vγ7均有表達(dá)(圖2B)。PCR結(jié)果基本與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致，并可補(bǔ)充流式細(xì)胞術(shù)不能檢測(cè)的亞群情況。

表2　引物序列Tab.2　Primer sequence

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各臟器中γδ T細(xì)胞的比例Fig.1　Flow cytometry detects proportion of γδ T cells in various tissues

圖2　流式細(xì)胞術(shù)及PCR技術(shù)檢測(cè)γδ T細(xì)胞亞群的組織分布Fig.2　Flow cytometry and PCR technique analyzes distributions of different γδ T cell subsetsNote: A.FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in various tissues;B.PCR technique detects expression of Vγ1-Vγ7 mRNA in various tissues.

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同部位γδ T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子Fig.3　Flow cytometry analyzes cytokine secretions of γδ T cells in various tissuesNote: A.FACS analyzes cytokine secretion of liver γδ T cells;B.FACS analyzes cytokine secretions of γδ T cells in various tissues.

2.3不同部位γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的差異小鼠γδ T細(xì)胞按分泌細(xì)胞因子IFN-γ與IL-17能力的不同可以分為4個(gè)亞群：IFN-γ+γδ T細(xì)胞(又稱(chēng)γδ T1細(xì)胞)、IL-17+γδ T細(xì)胞(又稱(chēng)γδ T17細(xì)胞)、雙陰的γδ T細(xì)胞與雙陽(yáng)的γδ T細(xì)胞。通過(guò)PMA與離子霉素的體外刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌(圖3)，我們發(fā)現(xiàn)肝臟γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力最強(qiáng)，且以分泌IL-17a為主(圖3B)。脾臟γδ T細(xì)胞分泌IFN-γ與IL-17a的能力相當(dāng)(圖3B)，胸腺γδ T細(xì)胞以分泌IL-17a為主(圖3B)，而IEL中γδ T細(xì)胞以分泌IFN-γ為主，幾乎檢測(cè)不到IL-17a的分泌(圖3B)。

圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)傷寒感染后小腸與肝臟中γδ T細(xì)胞亞群的分布變化Fig.4　FACS analyzes distribution changes of various γδ T cell subsets in liver and small intestine after Salmonella typhimurium infectedNote: A.3 days after Salmonella typhimurium infected,FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in IEL;B.5 days after Salmonella typhimurium infected,FACS analyzes the proportion of Vγ1+,Vγ4+ and Vγ5+ γδ T cells in liver.

2.4傷寒感染后不同組織γδ T細(xì)胞亞群分布變化已有研究表明，γδ T細(xì)胞在免疫防御、免疫監(jiān)視與某些疾病(例如病原菌感染[2]、腫瘤[10]與乙肝[11,12]等)的進(jìn)程中扮演重要角色。為了探討γδ T細(xì)胞在病理狀態(tài)下不同亞群分布的變化，我們選用了鼠傷寒沙門(mén)氏菌腸道感染模型進(jìn)行研究。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，傷寒感染第3天時(shí)，感染組小腸IEL中γδ T細(xì)胞比例明顯高于未感染對(duì)照組(P<0.05，圖4A)。其中Vγ1+γδ T細(xì)胞亞群比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05，圖4A)，Vγ4+與Vγ5+γδ T細(xì)胞亞群比例未見(jiàn)明顯變化(P>0.05，圖4A)。傷寒感染第5天時(shí)，肝臟γδ T細(xì)胞比例未見(jiàn)明顯差異(P>0.05，圖4B)，但Vγ1+γδ T細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05，圖4B)，Vγ4+γδ T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05，圖4B)。

3　討論

胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育的主要場(chǎng)所。αβ T與γδ T細(xì)胞來(lái)源于共同的前體細(xì)胞——淋巴樣前體細(xì)胞。由于其表面不表達(dá)CD4與CD8分子，又將這群細(xì)胞稱(chēng)為DN細(xì)胞。根據(jù)其表面CD44和CD25分子的表達(dá)，將DN細(xì)胞分為4個(gè)階段：DN1(CD44+CD25-)、DN2(CD44+CD25+)、DN3(CD44-CD25+)和DN4(CD44-CD25-)。DN細(xì)胞在DN3階段經(jīng)歷一系列有序的TCR基因重排與表達(dá)，決定其分化方向。如果DN細(xì)胞進(jìn)行Tcrb基因座重排，其會(huì)向αβ T細(xì)胞發(fā)育，而進(jìn)行Tcrg、Tcrd基因座重排，其會(huì)向γδ T細(xì)胞發(fā)育。在胚胎時(shí)期，γδ T細(xì)胞就開(kāi)始在胎胸腺內(nèi)進(jìn)行發(fā)育，并逐漸發(fā)育成熟，遷出胸腺至外周。

本研究發(fā)現(xiàn)，γδ T細(xì)胞富含于小腸、皮膚與肝臟中，在淋巴結(jié)、脾臟或胸腺中含量較低。小腸、皮膚與肝臟的一個(gè)共同特點(diǎn)是易于接觸外界抗原或病原菌，以天然免疫占優(yōu)勢(shì)。我們發(fā)現(xiàn)，不同γδ T細(xì)胞亞群在這些器官中的分布具有差異性。小腸主要以Vγ1+、Vγ4+與Vγ7+γδ T細(xì)胞亞群為主，皮膚主要以Vγ5+γδ T細(xì)胞亞群為主，而肝臟中所有6個(gè)亞群均能檢測(cè)到。在成年小鼠胸腺中檢測(cè)不到Vγ5+、Vγ6+與Vγ7+γδ T亞群的存在，提示這三個(gè)亞群在成年小鼠個(gè)體中可能不是在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的。已有研究表明，γδ T細(xì)胞存在胸腺外發(fā)育的現(xiàn)象，Vγ7+γδ T亞群可能是在小腸中發(fā)育而來(lái)的[13]，而肝臟亦可能是胸腺外發(fā)育的器官之一[14]。那么是否存在這樣的一個(gè)可能：在成年個(gè)體內(nèi)，肝臟作為γδ T細(xì)胞胸腺外發(fā)育分化的場(chǎng)所，源源不斷地維持著部分γδ T細(xì)胞亞群的更新。但是，由于肝臟獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有利于免疫細(xì)胞的駐留，所以不能排除肝臟中存在的γδ T細(xì)胞亞群是從其他器官遷移而來(lái)并在肝臟駐留的可能性。

γδ T細(xì)胞除了殺傷功能外，另一個(gè)重要的功能是分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-17與TNF-α等[15]。通過(guò)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，肝臟γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力最強(qiáng)，且以分泌IL-17a為主；而小腸γδ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力較弱，主要分泌IFN-γ。肝臟為具有免疫耐受特點(diǎn)的器官，其雖然能夠通過(guò)腸系膜靜脈接受腸道來(lái)源的大量外來(lái)抗原與微生物產(chǎn)物，卻不引起嚴(yán)重的炎癥應(yīng)答。肝臟與小腸γδ T細(xì)胞接觸相似的抗原刺激，產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力卻截然不同，這可能與γδ T細(xì)胞在其中發(fā)揮的功能不同相關(guān)。研究表明，小腸上皮內(nèi)γδ T細(xì)胞在抵抗腸道外來(lái)病原體感染過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用，并參與保護(hù)腸黏膜的完整性、維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[9,16]。而肝臟γδT細(xì)胞是產(chǎn)生IL-17最為豐富的細(xì)胞，在HBV慢性持續(xù)性感染和肝癌模型均發(fā)現(xiàn)肝臟γδT細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17誘導(dǎo)局部產(chǎn)生CXCL5，招募MDSC至炎癥或腫瘤部位，通過(guò)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞耗竭，參與維持HBV誘導(dǎo)的或腫瘤微環(huán)境的免疫耐受[10,11]。結(jié)合文獻(xiàn)與我們的結(jié)果，我們推測(cè)，腸道γδ T細(xì)胞主要通過(guò)殺傷功能和分泌IFN-γ發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視作用，而肝臟γδ T細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-17a等細(xì)胞因子在維持肝臟局部免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同γδ T細(xì)胞亞群具有組織分布特異性，其在不同的組織部位及在不同的疾病模型中亦可能發(fā)揮不同的功能。通常認(rèn)為，Vγ1+γδ T細(xì)胞具有抑炎作用，清除該亞群可增強(qiáng)小鼠對(duì)李斯特菌的清除能力[17]。研究發(fā)現(xiàn)，該亞群主要通過(guò)殺傷活化的巨噬細(xì)胞來(lái)控制炎癥進(jìn)程[18]。然而，Vγ4+γδ T細(xì)胞卻對(duì)巨噬細(xì)胞具有活化作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6與IL-10等細(xì)胞因子的能力[19]。在病毒介導(dǎo)的心肌炎模型中，也發(fā)現(xiàn)該亞群具有促進(jìn)炎癥的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在傷寒感染時(shí)，腸道與肝臟γδ T細(xì)胞亞群的分布發(fā)生明顯不同的變化，在感染第3天，小腸上皮內(nèi)總的γδ T細(xì)胞的比例明顯升高，尤其是Vγ1+γδ T細(xì)胞比例升高，而Vγ4+與Vγ5+γδ T細(xì)胞無(wú)變化，顯示此時(shí)小腸γδ T細(xì)胞處于抑制炎癥的狀態(tài)。在感染第5天時(shí)，肝臟總的γδ T細(xì)胞比例雖無(wú)明顯變化，但Vγ1+γδ T細(xì)胞比例下降，Vγ4+γδ T細(xì)胞比例升高，呈現(xiàn)了一種促進(jìn)炎癥的狀態(tài)。小腸與肝臟中γδ T細(xì)胞變化的差異是否與不同組織γδ T細(xì)胞特性、傷寒感染的程度或免疫應(yīng)答的進(jìn)程相關(guān)還有待下一步的研究。

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[收稿2015-10-29修回2016-01-05]

(編輯倪鵬)

Distinct distributions of mouse γδ T cells in various tissues and changes after infection

HU Yuan,LI Yan,GUAN Yun,ZHANG Cai.Institute of Immunopharmacology and Immunotherapy,School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University,Ji′nan 250012,China

Objective:The study focuses on the distinct distributions of γδ T cells in various tissues and the changesafterSalmonellatyphimuriuminfection,and attempts to explore the physiological significance of γδ T cell distribution and the role of γδ T cells in infectious diseases.Methods: Flow cytometry and PCR technique were used to detect the proportion of different γδ T cell subsets among thymus,spleen,lymph nodes,liver,skin,and intestinal intraepithelial lymphocytes.Flow cytometry was applied to detect the secretion of IFN-γ and IL-17a.The changes of various γδ T cell subsets in liver and intestinal intraepithelial lymphocytes were analyze afterSalmonellatyphimuriuminfection.Results: γδ T cells were rich in the intestinal epithelium,skin and liver,but poor in the thymus,spleen and lymph nodes.The distribution of different subsets was quite dissimilar.Vγ5+γδ T cells chiefly existed in skin,and Vγ1+,Vγ4+,Vγ7+γδ T cells largely existed in small intestine.γδ T cells in liver mainly secreted IL-17a;however,γδ T cells in intestinal intraepithelial secreted IFN-γ.After infection by Salmonella typhimurium,the proportion of γδ T cells in intestinal intraepithelial increased significantly,particularly Vγ1+γδ T cells.In Liver,there was no significant change of total γδ T cell ratio,but the ratio of Vγ1+γδ T cells reduced,Vγ4+γδ T cells raised.Conclusion: γδ T cells are rich in the intestinal epithelium,skin and liver.The distribution of different subgroups has specificity.There are large differences in the ability of cytokine secretion among various subgroups of γδ T cells.The distribution of γδ T cell subgroups in small intestine and liver changes duringSalmonellatyphimuriuminfection.

γδ T cells;Tissue distribution;Salmonellatyphimurium

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.005

R392.12文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1107-06

胡淵(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事肝臟免疫學(xué)研究，E-mail:huyuan_tx@163.com。

及指導(dǎo)教師：張彩(1965年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然免疫和肝臟免疫學(xué)研究，E-mail:caizhangsd@sdu.edu.cn。