乙型肝炎病毒蛋白誘導白細胞介素32表達情況的研究

張晶晶，謝永富，胡建峰，劉會晶，孫宏勛（河北醫科大學第三醫院 檢驗科，河北 石家莊 050051）

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乙型肝炎病毒蛋白誘導白細胞介素32表達情況的研究

張晶晶，謝永富，胡建峰，劉會晶，孫宏勛
（河北醫科大學第三醫院 檢驗科，河北 石家莊 050051）

目的探討乙型肝炎病毒蛋白誘導白細胞介素32（IL-32）的表達以及臨床意義。方法用Lipofectamine 2000TM介導轉染HepG2細胞。轉染48 h后，采用聚合酶鏈反應（RT-PCR），蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測HepG2細胞中IL-32的mRNA及蛋白的表達量。結果RT-PCR結果顯示轉染HBV的HepG2細胞中IL-32 mRNA的表達量比轉染空載體（未轉染）的細胞中IL-32 mRNA高2.3倍；Western blot結果顯示與空載體轉染的HepG2細胞比較，轉染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2細胞中IL-32蛋白質表達增高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。結論HBV促進IL-32蛋白的表達，從而證實乙型肝炎的嚴重程度與IL-32的表達有關。

乙型肝炎病毒蛋白；IL-32；表達；研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前嚴重威脅人類健康的病毒之一。HBV感染肝細胞后不僅極易引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾病，而且還會提高肝癌的發生率［1］。HBV感染宿主后，正常的免疫應答可以清除乙肝病毒，表現為急性一過性的感染。若是細胞免疫功能低下或紊亂者，則無法清除乙肝病毒，最終將成為慢性感染者［2］。白細胞介素32（Interleukin，IL-32）是一種重要的炎癥因子，主要經免疫細胞表達，IL-32為促炎因子。IL-32在丙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒引起的炎癥性疾病中發揮重要作用［3-4］。IL-32是否參與乙型病毒性肝炎的發病，國內外研究甚少，本研究在分子生化水平對HBV是否誘導IL-32的表達進行初步探索。

1　材料與方法

1.1實驗材料

細胞株：人肝癌細胞株HepG2細胞（購自北京協和技術所細胞庫），主要試劑：主要試劑及來源見表1。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養HepG2細胞培養在含10%胎牛血清、10%青鏈雙抗的DMEM培養基中，于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養，待貼壁細胞處于生長期時進行傳代。

1.2.2質粒轉染細胞用脂質體 Lipofectamine 2000TM介導轉染，在轉染前1 d換用不含雙抗的培養液，調整HepG2細胞濃度為1×105個/rat，將其接種于24孔板中，每孔1 ml。用OPTI-MEM稀釋質粒和脂質體，當細胞貼壁密度達到90%融合時，把質粒、脂質體混合物加至細胞中。轉染6 h后更換培養液為含雙抗的培養液，第2天熒光下觀察轉染率達50%。

1.2.3RT-PCR檢測HBV轉染IL-32 mRNA的表達量將上述細胞培養48 h后，除去培養液，用PBS（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，然后加入Trizol。按試劑盒說明提取總RNA。采用分光光度法（A260/280 nm值）檢測每一個RNA樣本的質量。利用反轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄。采用SYBR GreenⅠ染料法對IL-32基因的表達量進行檢測，反應體系為25μl：2×Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Bio-system）10μl，10μmol/L的正反向引物各加1μl，模板為總RNA逆轉錄所得的cDNA，用滅菌雙蒸水補足至25μl。各處理組分別做3～4個平行樣品，每個樣品再分別平行做3個重復。各個樣品的反應條件為：95℃、3 min，40個循環：95℃、15 s，60℃、45 s；60℃延伸步驟進行熒光信號的采集。反應結束后，收集本反應體系的融解曲線，以此分析PCR產物的特異性。目的基因相對表達量分析方法采用 2-△△CT法計算。IL-32引物參照KOBAYASHI等［5］：正向引物5'-CGACTTCAAAGAGG GCTACC-3'，反向引物5'-GAGTGAGCTCTGGGTGC TG-3'；β-actin引物：正向引物5'-TCGTCCACCGCA AATGCTTCTAG-3'，反向引物5'-ACTGCTGTCACCT FCACCGTTCC-3'，采用雙△t法計算結果。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測HBV轉染IL-32蛋白的表達量影響收集未轉染以及轉染48 h的細胞，沖洗2次，置放射免疫沉淀分析緩沖液中萃取蛋白，置冰上30 min。采用超聲勻漿器處理標本，用未轉染細胞做對照，采用Lowry法測定蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE（150 V，2 h）分離蛋白，并轉到硝酸纖維膜上，用5%的牛血清白蛋白封閉1 h，加1∶2 000的Mouse anti-IL-32單抗孵育過夜，第2天，沖洗掉一抗，在用1∶5 000的辣根過氧化酶結合的Goat anti-mouse IgG孵育1 h。采用增強化學發光法檢測蛋白質。Mouse-anti-β-actin單克隆抗體作為內對照。

表1　試劑列表

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HBV對IL-32 mRNA的表達量的影響

實時熒光定量PCR結果顯示，轉染HBV 48 h后的HepG2細胞，比轉染空載體（未轉染）的細胞中的IL-32 mRNA表達量高2.3倍（見圖1，2和表2），并且溶解曲線顯示IL-32，以及β-actin的引物特異性良好，進一步顯示數據具有可靠性。

結果可見，通過對未轉染細胞和轉染細胞中βactin統計分析可以看出，β-actin表達在兩組比較差異無統計學意義，而對未轉染細胞和轉染細胞中RNA IL-32 mRNA的含量可以看出未轉染細胞RNA IL-32 mRNA表達明顯高于轉染細胞，差異有統計學意義，見表2。

2.2HBV對IL-32蛋白的表達量的影響

圖1　未轉染細胞中IL-32及β-actin的擴增曲線

圖2　轉染細胞中IL-32及β-actin的擴增曲線

Western blot結果顯示，轉染48h的HepG2細胞，與空載體轉染的HepG2細胞比較，轉染HBV的HepG2細胞中IL-32蛋白質表達顯著增高（P＜0.05）。見表3和圖3。

表2　HBV對IL-32 mRNA的表達量影響 （dRn±s）

表2　HBV對IL-32 mRNA的表達量影響 （dRn±s）

表3　HBV對IL-32蛋白的表達量的影響

圖3　Western blot結果圖

3　討論

近年的研究［6-7］證實，細胞因子在HBV感染所引起的肝損傷中發揮重要作用。許春梅等［8］檢測HBV患者血清中IL-32水平，發現IL-32水平與HBV感染者的炎癥嚴重程度相關，并且隨炎癥程度的加重IL-32呈上升趨勢。PAN等［9］證明HBV的X蛋白（HBx）通過IL-32的啟動子（從-746到+25）以劑量依賴的方式增強IL-32的表達。IL-32是2005年KIMETAL［10］在用基因芯片方法研究IL-18可誘導基因時發現的一種新型白細胞介素。越來越多的研究表明，IL-32在機體的免疫調節方面發揮著重要作用，它與慢性炎癥性疾病、細菌感染性疾病、腫瘤和病毒感染性疾病等密切相關［11］。疾病中所起的作用不同，IL-32可以誘導IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα及MIP-2等細胞因子的表達，與HCV［3］、HPV等［12］多種病毒感染引起的疾病的發病密切相關。IL-32基因位于人染色體16p13.3上，有8個外顯子，有6種以上剪接變異體，目前比較明確的是 IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ6種［13］。

IL-32可由多種細胞刺激產生，如T淋巴細胞可在絲裂原等的刺激下、在IL-12和IL-18的共同作用下或在TNF-α的作用下產生，NK細胞可在IL-12和IL-18的共同作用下產生，單核細胞和B細胞均可在活化T細胞的輔助下產生，上皮細胞在IFN-γ的作用下亦可產生等［14］。本研究中顯示轉染HBV的HepG2細胞比未轉染的HepG2細胞中的 IL-32 mRNA的表達量高2.3倍，說明HBV促使IL-32 mRNA的表達，是由于HBV感染引起肝損傷與增加炎癥因子的表達有關。同時，本研究結果顯示，轉染HBV的HepG2細胞中IL-32蛋白比未轉染HBV的細胞中IL-32蛋白表達量高，說明HBV促進HepG2細胞中的IL-32蛋白的表達。本研究發現，轉染HBV表達載體的HepG2細胞內及培養上清液中均表達IL-32，分泌表達的IL-32可通過誘導其他炎癥細胞因子的表達而引起炎癥疾病的發生，進一步從蛋白水平說明HBV感染引起肝損傷與增加炎癥因子的表達有關。

綜上所述，本文通過檢測轉染及未轉染HBV的HepG2細胞中的IL-32 mRNA及蛋白的表達量，探究HBV對IL-32的表達，研究結果證明HBV對IL-32的mRNA及蛋白的表達均有促進作用。

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（張蕾編輯）

Expression of IL-32 induced by hepatitis B virus protein

Jing-jing Zhang，Yong-fu Xie，Jian-feng Hu，Hui-jing Liu，Hong-xun Sun
（Department of clinical laboratory，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050051，China）

Objective To investigate whether protein of hepatitis B virus induced the expression ofIL-32. Methods HepG2 was mediated transfected by Lipofectamine 2000 TM.After 48 hours，the expressions of IL-32 mRNA and protein in HepG2 cells were detected by RT-PCR and western blot respectively.Results RT-PCR result showed expressions of IL-32 mRNA in HepG2 cells transfected with HBV were 2.3 times higher than the cells transfected with empty vector（non-transfected）.Western blot result showed that，compared with the IL-32 protein in untransfected HepG2 cells，expression ofIL-32protein in transfected pIRES2-HBV-EGFP HepG2 cells was increased，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The expression ofIL-32mRNA，IL-32protein in HepG2 cells is promoted by HBV.

hepatitis B virus protein；IL-32；expression；study

R575.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.007

1005-8982（2016）16-0035-04

2016-04-08

謝永富，E-mail：xieteng811@sohu.com；Tel：13503339862