S100A11-RAGE通過P38MAPK信號轉導通路調控小鼠骨關節炎軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝

趙曉，黃飛麒，姚乃婕，陳揚聲

（廣東藥科大學附屬第一醫院 正骨科，廣東 廣州 510080）

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S100A11-RAGE通過P38MAPK信號轉導通路調控小鼠骨關節炎軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝

趙曉，黃飛麒，姚乃婕，陳揚聲

（廣東藥科大學附屬第一醫院 正骨科，廣東 廣州 510080）

目的探討S100A11-RAGE通過P38MAPK信號轉導通路對小鼠骨關節炎軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝的調控。方法不同濃度的外源性S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）與小鼠軟骨細胞孵育48 h，檢測基質金屬蛋白酶13（MMP-13）、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白表達，以篩選作用最顯著的S100A11濃度。加入不同濃度Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）與小鼠軟骨細胞預孵育12 h后，再加入作用最強的外源性S100A11孵育（10μg/ml）48 h，檢測MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白表達。結果小鼠軟骨細胞MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達隨外源性S100A11濃度的增加而增加，且明顯高于對照組；而Ⅱ型膠原蛋白表達隨外源性S100A11濃度的增加而減少，且明顯低于對照組。加入Anti-P38預處理后，MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達均明顯低于S100A11單獨處理組，而Ⅱ型膠原蛋白表達明顯高于S100A11單獨處理組。結論外源性S100A11通過與RAGE結合，并經P38MARK信號轉導通路誘導軟骨細胞肥大和細胞外基質的降解，其機制可能與通過P38MAPK信號轉導通路誘導MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達，并降低Ⅱ型膠原蛋白表達。

S100A11-RAGE；P38MAPK信號轉導通路；軟骨細胞肥大；細胞外基質代謝

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種慢性進行性骨關節疾病，其發病率隨年齡的增長而顯著增加，流行病學研究顯示，55歲以上中老年人OA發病率為44%～70%，而65歲以上人群中男性發病率為60%，而女性達70%［1］。OA的病因機制較為復雜，受年齡、遺傳、創傷及代謝等多種因素的影響，而年齡是引起OA發病和進展的最重要的危險因素之一［2］。隨著我國人口老齡化的加劇，OA的發病呈日益增高的趨勢，所以對于OA的防治具有十分重要的意義。有研究認為，OA是由于多種炎癥介質和基質成分等生物性因素，通過與其受體特異性地結合將信號傳遞進細胞核，啟動炎癥基因和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的轉錄表達，最終導致關節軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝失調［3］。

已有研究證實，晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）能通過直接或經由不同的細胞內信號轉導通路參與包括類風濕性關節炎、糖尿病腎病、骨質疏松、阿爾茨海默病以及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種疾病的發生、發展［4］。但RAGE在OA的發生、發展中起到何種作用，尚不十分清楚，有研究認為這可能與AGEs/RAGE觸發活化促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）信號轉導通路有關［5］。P38信號轉導途徑是MAPK途徑的一種，研究顯示，P38MAPK信號轉導通路與軟骨細胞表型維持和細胞分化，軟骨細胞的肥大、鈣化和凋亡，軟骨細胞基質金屬蛋白酶的合成以及炎癥因子的產生等密切相關。S100蛋白被認為是一組鈣離子傳感器，通過鈣離子信號轉導途徑在細胞增殖、分化、黏附、運動、基因表達及凋亡過程中發揮重要作用。其家族成員S100A4、S100A6和S100A13等已被證實可促進骨肉瘤的侵襲、轉移［6-8］。S100蛋白的另一家族成員S100A11則參與多種細胞內的活性調節［9］，在胃癌、結腸癌和乳腺癌等腫瘤的發生、發展中的作用已有較多研究［9-11］。研究顯示，當軟骨細胞受到白細胞介素1等促炎癥因子刺激時S100A11會釋放到軟骨細胞外與RAGE結合，從而促進軟骨細胞肥大。本研究旨在通過外源性S100A11及P38MAPK信號轉導通路相關抑制劑，作用于小鼠軟骨細胞后對MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達的影響，以探明S100A11-RAGE和P38MAPK信號轉導通路對小鼠軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝的調控，旨在揭示OA的發病機制，為研發有效的防治藥物開辟新的思路，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

RMIP 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國），Ⅱ型膠原蛋白酶（Gibico公司，美國），S100A11、anti-RAGE、anti-P38（Santa Cruz公司，美國），MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白單克隆抗體、非免疫性山羊血清、熒光二抗（Santa Cruz公司，美國），TRIzol（Invitro-gen公司，美國），PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），逆轉錄試劑盒（ABI Applied Biosystems公司，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠軟骨細胞的培養無菌條件下，麻醉后取小鼠髖關節和膝關節處軟骨，剪成1 mm3小塊，轉移至培養瓶內，加入0.25%的胰蛋白酶，5%二氧化碳CO2、37℃培養箱中孵育1h，棄去胰蛋白酶，加入0.2%的Ⅱ型膠原蛋白酶，繼續孵育消化。2 h后，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，所得細胞接種于含10% FBS的RMIP 1640P培養基，5%二氧化碳CO2、37℃培養箱中培養。實驗用細胞為1～3代。

1.2.2實驗分組與干預在小鼠軟骨細胞中加入不同濃度的外源性 S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育48h后，檢測MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達，以篩選作用最顯著的S100A11濃度。

在小鼠軟骨細胞中加入Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育12 h后，再加入前面篩選出的作用最顯著的SA00A11濃度（10μg/ml）。孵育48 h后，檢測MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達，以觀察阻斷P38MAPK信號轉導通路后，對小鼠軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝的影響。

1.2.3PCR檢測MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表達提取總細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。參照文獻［4］，設計MMP-13、ADAMTS-5以及G3PDH的引物，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。MMP-13正向引物：5'-CTTGATGCCATTACCAGTC-3'，反向引物：5'-GGTTGGGAAGTTCTGGCCA-3'。ADAMTS-5正向引物：5'-TATGACAAGTGCGGAGTATG-3'，反向引物：5'-TTCAGGGCTAAATAGGCAGT-3'。GAPDH正向引物：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3'。PCR擴增參數：94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s、共32個循環，最后72℃延伸7 min。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western b l ot） 檢測MMP-13和ADAMTS-5蛋白表達收集各組細胞，PBS淋洗后加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解30 min，刮離細胞轉移至離心管，20 000 r/min離心30 min，取上清液置入-20℃冰箱冷凍保存備用。分別以50μg等量總蛋白上樣，經8%SDS-PAGE電泳分離，轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，TBST淋洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過夜；TBST淋洗，加入辣根過氧化物酶標記的熒光二抗，37℃孵育1 h；TBST淋洗，DAB顯色。

1.2.5免疫細胞化學檢測Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達取對數生長的小鼠軟骨細胞按1×105的密度接種于6孔板中，將2%多聚賴氨酸包被處理的玻片置于孔中以進行細胞爬片；培養24 h后，待細胞緊貼玻片，取出玻片，PBS淋洗，95%酒精固定；PBS淋洗，加過氧化酶阻斷劑，37℃孵育30 min；PBS淋洗，加非免疫性山羊血清，37℃封閉30 min；PBS淋洗，加一抗，4℃孵育過夜；PBS淋洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS淋洗，DAB染色，蘇木精復染，95%酒精脫水，透明，封片，每張切片任選5個視野，采用Image Pro plus 6.0軟件進行半定量分析，測量每張切片陽性染色灰度值［5］。

1.3統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，并行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度S100A11對MMP-13和ADAMTS-5表達的影響

不同濃度外源性S100A11孵育48 h后，小鼠軟骨細胞MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及其蛋白的表達較對照組顯著上調（P=0.031，0.022和0.009），且其表達呈濃度依賴性增加，以S100A11為10μg/L時表達最強。見圖1。

2.2不同濃度S100A11對Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達的影響

Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色灰度值隨S100A11濃度增大而增大，且明顯低于對照組（P= 0.000）（見圖2A）；Ⅹ型膠原蛋白灰度值隨S100A11濃度增大而減小，且明顯高于對照組（P=0.026）（見圖2B）。提示隨S100A11濃度增大，Ⅱ型膠原蛋白表達逐漸減少，明顯低于對照組（P=0.007）；而Ⅹ型膠原蛋白表達逐漸增加，明顯高于對照組（P=0.018）。

圖1　PCR和Western blot檢測不同濃度S100A11處理后小鼠軟骨細胞MMP-13和ADAMTS-5的表達，條帶圖下面對應的是條帶灰度值的柱狀圖

圖2　免疫組織化學檢測分析不同濃度S100A11處理對小鼠軟骨細胞Ⅱ和Ⅹ型膠原蛋白表達的影響，右圖為對應灰度值的柱狀圖

2.3Anti-P38對MMP-13和ADAMTS-5表達的影響

不同濃度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，檢測MMP-13和ADAMTS-5的表達。結果顯示，MMP-13和ADAMTS-5的mRNA及蛋白的表達隨Anti-P38濃度的增加而減少，且明顯低于S100A11單獨處理組（P=0.004）。見圖3。

2.4Anti-P38對Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達的影響

不同濃度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，檢測Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達。結果顯示，Ⅱ型膠原蛋白的表達隨Anti-P38濃度的增加而減少，且明顯低于S100A11單獨處理組（P=0.001）；Ⅹ型膠原蛋白的表達隨Anti-P38濃度的增加而增加，且明顯高于S100A11單獨處理組（P=0.002）。見圖4。

圖3　Anti-P38對MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及相應蛋白表達的影響

圖4　Anti-p38對Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達的影響

3　討論

OA的病理生理過程主要表現為關節軟骨細胞的分解代謝明顯大于合成代謝，導致軟骨基質進行性丟失。OA發病時，各種基質金屬蛋白酶的表達和含量明顯增高，加劇細胞軟骨基質的分解，其中基質金屬蛋白酶MMP-13對于Ⅱ型膠原蛋白具有強烈的裂解作用，在OA的發生、發展中起著十分重要的作用［12］。ADAMTS-5是細胞軟骨基質蛋白聚集蛋白聚糖Aggrccan的降解酶，研究發現，OA患者骨關節中存在Aggrccan被大量降解破壞的現象［13］。Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖Aggrccan是軟骨基質中的主要成分，Ⅱ型膠原蛋白是構成纖維網架結構的主體，具有很強的抗張性，而聚集蛋白聚糖Aggrccan對于關節的抗壓力和分散負荷等具有重要作用，兩者的表達和凋亡情況是反應軟骨退變程度的最好指標［14］。當軟骨細胞分化到增生末期時，Ⅹ型膠原蛋白的合成達到頂峰，提示Ⅹ型膠原與軟骨骨化相關；而在OA中，觀察到軟骨基質退化后期Ⅹ型膠原蛋白表達的增加［15］。所以本研究選擇MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白作為反映OA病變的主要檢測指標。

年齡是引起OA發病和進展的最重要的危險因素之一。有研究認為，隨著年齡的增加體內大量AGEs的產生和堆積是導致和加速年齡相關性OA病變的主要原因之一［16］。其機制可能與AGEs與RAGE特異性結合并激活細胞內一系列信號轉導通路相關。

RAGE配體除了AGEs外還包括β淀粉樣蛋白、高遷移率族蛋白1等等，而S100A11也是RAGE的配體。為探明S100A11-RAGE和P38MAPK信號轉導通路對小鼠軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝的調控，本研究首先采用不同濃度的外源性S100A11作用于體外培養的小鼠軟骨細胞，結果發現隨著S100A11濃度的增加，小鼠軟骨細胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅹ型膠原蛋白的表達較對照組顯著上調，而Ⅱ型膠原蛋白的表達卻逐漸減少。研究證實，外源性S100A11能通過與RAGE結合調控小鼠軟骨細胞肥大和細胞外基質代謝。進一步的研究發現，小鼠軟骨細胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅱ型膠原蛋白的表達隨Anti-P38濃度的增加而顯著減少，而Ⅹ型膠原蛋白的表達卻隨Anti-P38濃度的增加而增加。提示P38 MARK抑制劑Anti-P38可以顯著抑制由外源性S100A11誘導的軟骨細胞肥大和基質代謝增加。

綜上所述，本研究通過體外培養小鼠軟骨細胞，初步論證外源性S100A11通過與RAGE結合，并經P38MARK信號轉導通路誘導軟骨細胞肥大和細胞外基質的降解，從而導致軟骨細胞功能障礙，研究旨在揭示OA的發病機制，為研發有效的防治藥物開辟新的思路。

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（張蕾編輯）

Regulation ofS100A11-RAGEon hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byp38MAPK signal pathway in mice

Xiao Zhao，Fei-qi Huang，Nai-jie Yao，Yang-sheng Chen
（Department of Bone Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong 510080，China）

Objective To investigate the regulation ofS100A11-RAGEon the hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byP38MAPKsignal pathway in mice.Methods Different concentrations of exogenousS100A11and cartilage cells were incubated for 48 h.Expressions ofMMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected by PCR，Western Blot and immunohistochemistry，respectively.Anti-P38 and cartilage cells were incubated for 12 h，and then incubated 48 h after exogenous S100A11 was added.Expressions of MMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected.Results The expression ofMMP-13，ADAMTS-5 and type X collagen of cartilage cells increased with the increase of the concentration of exogenous S100A11，and was significantly higher than that of the control group.The expression of typeⅡ collagen decreased with the increase of the concentration of exogenousS100A11，and was significantly lower than that of the control group.After the addition of Anti-P38，the expressions ofMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen were significantly lower than that of S100A11 alone treatment group，and the expression of typeⅡcollagen was significantly higher than that of S100A11alone treatment group.ConclusionsS100A11-RAGEcan regulate the hypertrophy and extracellular matrixdegradation of chondrocytes in mice，and the mechanism may be related to the inducedMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen expression and reduce typeⅡcollagen expression through the P38 MAPK signal pathway.

S100A11-RAGE；P38MAPK signaling pathway；chondrocyte hypertrophy；extracellular matrix metabolism

R684

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.002

1005-8982（2016）16-0006-06

2016-01-11