氯化鋰對U251膠質(zhì)瘤細胞增值及GSK-3β蛋白表達影響的研究

伍世表廣東省中醫(yī)院腦病科，廣東廣州　510006

氯化鋰對U251膠質(zhì)瘤細胞增值及GSK-3β蛋白表達影響的研究

伍世表
廣東省中醫(yī)院腦病科，廣東廣州510006

目的 探討GSK-3抑制劑（Licl）治療腦膠質(zhì)瘤的可行性及其機制。方法 于2015年1月—2015年6月期間將U251細胞經(jīng)復蘇處理后，經(jīng)DMEM培養(yǎng)液并在接種后24 h達到連續(xù)傳代對數(shù)生長期；分別將不同濃度的LiCl作用于U251細胞24、48 h；并對比不同濃度與不同作用時間下細胞的存活率、細胞周期改變情況以及GSK-3β蛋白的表達情況。結(jié)果 處理前，U251膠質(zhì)瘤細胞的MTT值為1.0，不同濃度LiCl作用U251膠質(zhì)瘤細胞24 h后，MTT值下降為0.45，與處理前比較結(jié)果顯示藥物組的MTT值顯著低于未處理組，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05，并呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論 LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達。

氯化鋰；膠質(zhì)瘤；增值；蛋白表達

［Abstrct］Objective To investigate the feasibility of GSK-3 inhibitor（Licl）and its mechanism of treating brain glioma. Methods During the period from January 2015 to June 2015 will be U251 cell recovery after treatment by DMEM medium and at 24 h after inoculation to continuous passage of the logarithmic growth phase；then different concentration of LiCl in U251 cells and 24h，48h；comparison of cells at different concentrations and different action time on the survival rate，the changes of cell cycle and the expression of GSK-3 beta protein.Results Before treatment，U251 glioma cells MTT 1，different concentrations of LiCl in U251 glioma cells after 24 h，the MTT value decreased to 0.45，compared with the results before treatment showed drug group the MTT value was significantly lower than that in the untreated group，with statistical significance，P＜0.05，in a dose-dependent manner.Conclusion LiCl inhibitors can significantly inhibit the proliferation of U251 glioma cell lines，and can adjust the GSK-3 beta Protein expression.

［Key words］Lithium chloride；Glioma；Proliferation；Expression

膠質(zhì)瘤是較為常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，其具有復發(fā)率高、致殘率高、病死率高的特點，治療難度非常大量，是繼腦卒中后人類健康的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。該組所有研究均于2015年1月—2015年6月期間完成，以膠質(zhì)瘤細胞株（U251）作為研究樣本，分別將不同濃度的LiCl作用于U251細胞24、48 h；并對比不同濃度與不同作用時間下細胞的存活率、細胞周期改變情況以及GSK-3β蛋白的表達情況，以分析GSK3在膠質(zhì)瘤治療中的分子機制與可行性，并為今后的工作提供參考，現(xiàn)報道下。

1　資料與方法

1.1一般資料

該組所有研究均于2015年1月—2015年6月期間完成，采購U251細胞（上海細胞庫），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購于美國 Gibco公司，Lithium chloride購于Sigma公司，GSK-3β兔抗人單克隆抗體購于CST公司，MTT購于AMRESCO公司，RNase A、碘化丙碇（Pl）購于BIOSHARP公司。

1.2方法

1.2.1噻唑藍比色分析法 （MTT實驗）用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液將U251細胞（對數(shù)生長期）制成懸浮細胞，并在無菌96孔板培養(yǎng)24 h后，分別加入200 uLmL的LiCL藥物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 uL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸走上清液，每孔加入150 uL的DMSO，避光振蕩溶解10 min，檢測波長490 mm時各孔的吸光值（OD）［2］。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞周期以0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM LiCl藥物作用U251細胞24 h后，將U251細胞消化制成細胞懸液，計數(shù)達到4×106個/mL，離心（1 000 r/min，5 min）棄去培養(yǎng)液；PBS洗2次，離心（1 000 r/min，5 min）棄去PBS，加入-20℃預冷的70%乙醇，置于-20℃固定過夜。離心（1 000 r/min，5 min）棄去固定液 ，PBS重懸2次×5min，離心（1 000 r/min，5 min）后棄去 PBS；采用PI染色液，室溫避光染色5 min后上樣，樣品計數(shù)達2.0×104個細胞 ，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀檢測U251細胞在細胞周期各時相所占的百分比。

1.2.3細胞免疫化學 用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液將U251細胞（對數(shù)生長期）制成懸浮細胞，并接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2 h后，每孔加1 mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，分別加入1 mL的LiCL藥物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培養(yǎng)至48 h時，吸走培養(yǎng)液，漂洗3次，加入500 uL 4%多聚甲醛，冰箱中冷藏20 min（4℃）；吸走4%多聚甲醛，并用PBS溶液洗5次，3 min/次。再按照SP免疫組化試劑盒進行操作，最后顯微鏡下觀察、計數(shù)［3］。

1.3統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用EpiData軟件進行雙錄入，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

結(jié)果顯示藥物組的MTT值顯著低于未處理組，處理前，U251膠質(zhì)瘤細胞的MTT值為1.0，不同濃度LiCl作用U251膠質(zhì)瘤細胞24h后，MTT值下降為0.45，與處理前比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05，并呈劑量依賴關(guān)系（圖1）。

圖1　MTT比色法示各濃度細胞的吸光度值（P＜0.05）

3　討論

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是真核生物中普遍存在的多功能絲氨酸/蘇氨酸類激酶［4］。關(guān)于GSK-3最早的研究是將其作為糖代謝的主要限速酶，參與糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成的研究之中。近年來，隨著研究的不斷深入目前已經(jīng)至少發(fā)現(xiàn)三條腫瘤轉(zhuǎn)導通路與GSK-3密切相關(guān)，而且已經(jīng)有研究證實通過調(diào)節(jié)GSK-3活性能夠明顯促進腫瘤細胞的生長或凋亡［5］。

該組研究中，U251膠質(zhì)瘤細胞在不同濃度LiCl作用后，其增殖被明顯抑制，并且抑制的程度與LiCl的濃度成正相關(guān)；而且U251細胞的細胞增殖期明顯減少，GSK-3β蛋白表達明顯增加，且增加的程度與LiCl的濃度成正相關(guān)；其細胞核增加的程度最為明顯，結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達。證明LiCl抑制劑治療膠質(zhì)瘤具有可行性，能為下一步的機制研究提供初步的分子基礎(chǔ)。關(guān)于GSK-3對腫瘤細胞抑制作用的機制尚無明確結(jié)論，有研究表明［5］GSK-3通過激活β-catenin相關(guān)基因，抑制了腫瘤細胞活性，促進腫瘤細胞的增殖。大量國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)［6］，LiCl是GSK-3的選擇性抑制劑，經(jīng)LiCl處理后GSK-3的磷酸化會明顯增加，該文中利用LiCl抑制U251增殖與活性，從而促進腫瘤的發(fā)生［7］，主要是導致GSK-3β無法磷酸化細胞內(nèi)的β-catenin，使β-catenin在細胞內(nèi)聚集并移向胞核和T細胞因子和淋巴細胞增強因子相結(jié)合，激活下游基因，導致腫瘤細胞的增殖；下降或上調(diào)GSK-3β的活性可以影響腫瘤的細胞生長［8］。

綜上所述，LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達，但是關(guān)于其對膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用尚無明確依據(jù)，需要在今后的工作中通過大量臨床研究以證實。

［1］梁林輝，王英成，韋錦學.利培酮在U251細胞中調(diào)節(jié)PI3K-Akt-GSK3β信號通路的研究［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2014，44（13）：11608-1162.

［2］L Liu，Z Dong，J Liang.As an independent prognostic factor，F(xiàn)AT10 promotes hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma progression via Akt/GSK3β pathway［J］.Oncogene 2014，13（7）：419-422.

［3］唐智，何正文，蔡皞.全反式維甲酸聯(lián)合替莫唑胺對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖與凋亡的影響 ［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013，5（2）：168-169.

［4］GH Sun，YD Liu，G Yu.Increased FAT10 expression is related to poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology&Medicine，2014，35（11）：19-25.

［5］Q Wang，YY Zhai，JH Dai.SAMD9L inactivation promotes cell proliferation via facilitating G1-S transition in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.International Journal of Biological Sciences，2014，14（7）：4416-4429.

［6］楊志英，鄧志剛，伍健明，芹菜素對U251膠質(zhì)瘤細胞生長及 p21、p53蛋白表達的影響 ［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，13（37）：551-556.

［7］FM Gu，QL Li，Q Gao.IL-17 induces AKT-dependent IL-6/JAK2/STAT3 activation and tumor progression in hepatocellular carcinoma［J］.Molecular Cancer，2011，2（25）：275-279.

［8］Rui Chu，Guangquan Mo，Zhijun Duan.miRNAs affect the development of hepatocellular carcinoma via dysregulation of their biogenesis and expression［J］.Cell Communication& Signaling Ccs，2014，16（38）：187-192.

Study of Proliferation and Protein Expression of GSK3β by Lithium Chloride in Human Glioma Cell Line U251

WU Shi-biao
Department of encephalopathy，Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou，Guangdong Province，510006 China

R739

A

1674-0742（2016）07（b）－0028-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.20.028

伍世表（1982.7-），男，廣東茂名人，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：腦膠質(zhì)瘤。

（2016-04-16）