84株沙門菌耐藥特征及分子分型結果分析

林茂銳，周　旋，李明友，黃基偉，劉桂治，曹東林

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84株沙門菌耐藥特征及分子分型結果分析

林茂銳，周旋，李明友，黃基偉，劉桂治，曹東林

目的分析廣東省第二人民醫院2012-2014年臨床常見沙門菌耐藥特性及分子分型特征。方法對分離的84株沙門菌進行血清分型、藥物敏感試驗。選取不同菌株來源、血清型和耐藥譜的51株沙門菌，按照美國PulseNet標準進行脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型。應用BioNumerics軟件對電泳圖譜進行分析，確定菌株間的相關性。結果84株菌分為20種血清型，沙門菌前3位血清型構成比從高到低分別為：鼠傷寒沙門菌占42.86%(36/84)、腸炎沙門菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙門菌占8.33%(7/84)。本次分離沙門菌對頭孢類抗生素敏感率達84.21%以上，對于環丙沙星與氯霉素的敏感性在66.67%以上，對于甲氧芐啶與慶大霉素的敏感性在50.88%以上，但仍存在多株多重耐藥現象。51株沙門菌經過聚類分析可分為 42個PFGE型，表現為較大的遺傳多樣性。結論臨床治療時，應根據藥敏試驗結果指導臨床，合理使用抗生素，以提高治療效果。沙門菌耐藥譜與 PFGE分型無明顯關聯。

沙門菌；耐藥性；脈沖場凝膠電泳

Supported by the Guangdong Province Medical Science and Technology Research Fund (No.C2012036) and 2013 Annual Guangdong Provincial Finance Technology Development and Application of Special Fund Project (No.Guangdong[2013]401)

沙門氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，至今已有2 523種血清型被發現[1]。據世界衛生組織報告，1985年以來，在世界范圍內，由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數呈上升趨勢，在一些歐洲國家已增加5倍以上[2-3]。WHO對沙門菌感染十分重視，早在2000年就成立世界范圍的全球沙門菌監測系統，廣東省疾病預防控制中心(CDC)從 2007年起加入全球沙門菌監測系統，全方位監測本地區臨床常見菌株類型的分布與傳播，及其對常用抗菌藥物的敏感程度。我院作為廣東省疾病預防控制中心的監測哨點醫院，共監測了3 200余人次。我們收集分析了本院2012年到2014年檢測出的84株沙門菌的菌株，進行耐藥性分析和脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型，為臨床合理使用抗生素，提高治療效果，控制耐藥菌株產生提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1標本來源按照廣東省CDC沙門菌監測對象標準，選擇24 h內連續腹瀉3次及以上，且糞便性狀異常者；或出現發熱，體溫38 ℃以上，伴有頭痛、寒戰、全身乏力等癥狀者；或出現嘔吐、腹瀉、腹痛，糞便性狀異常者，可為稀便、水樣便、黏液便、膿血便及血便。凡符合以上兩條及以上者，為標本留取對象。2012年1月至2014年12月廣東省第二人民醫院門診及住院患者糞便標本中分離出沙門菌84株。

1.2試劑和儀器血瓊脂平板由梅里埃(上海)生物制品有限公司提供,SBG(磺胺增菌肉湯)、XLD(木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽)培養基和沙門氏菌顯色培養基由廣州迪景微生物科技有限公司提供，沙門菌屬血清診斷試劑盒購自寧波天潤生物藥業有限公司，美國BD公司Phoenix100全自動細菌鑒定藥敏儀及配套試劑。Seakem Gold瓊脂糖購自美國Cambrex公司；XbaⅠ酶購自美國Promega公司；CHEF Mapper脈沖場電泳儀和美國Bio-Rad公司Gel Doc EQ凝膠成像系統；Dade Microscan濁度儀購自美國Dade Behring公司。

1.3分離培養及鑒定采集新鮮糞便標本，保存于Cary-Blair運送培養基中并送至實驗室，接種于SBG磺胺增菌肉湯，37 ℃培養過夜，轉種于XLD和沙門菌顯色培養基，繼續37 ℃培養過夜。挑取可疑菌落用血清凝集法做初步生化鑒定，結果符合者送廣東省CDC，復核APl20E生化鑒定及血清分型。

1.4藥物敏感試驗挑取初步生化鑒定符合單菌落，按照美國BD公司Phoenix100全自動細菌鑒定藥敏儀操作規程對菌落進行藥敏鑒定。結果判定參照美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute．CLSI)出版的藥物敏感試驗指南(2012版)。

1.5PFGE實驗參照美國PulseNet的沙門菌PFGE的標準操作方法，見文獻。

1.6統計學分析應用BioNumerics 4.0軟件處理電泳圖像，聚類分析選擇組間非加權的幾何平均數(unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA)方法，采用基于條帶比較的Dice系數衡量PFGE帶型之間的相似度，相似度為100%者視為同一PFGE型。

2　結　果

2.1檢測情況在收集檢測的84份沙門菌株中，男女比例差別不大(1.1∶1)，而在季節分布上以每年的7—10月份為高發期(見圖1)，人群年齡分布上以5歲以下嬰幼兒為主，占67.86%(57/84)，其次中老年人群比例稍高，大于50歲人群比例為14.29%(12/84)。

圖1　2012—2014年各月份沙門菌檢出率Fig.1　Detection rate of Salmonella in different month in 2012—2014

2.2血清分型結果對所有沙門菌進行血清分型，84株菌分為20種血清型。沙門菌前3位血清型構成比從高到低分別為：鼠傷寒沙門菌占42.86%(36/84)、腸炎沙門菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙門菌占8.33%(7/84)。另外羅森沙門菌、韋太夫雷登沙門菌分別為8.33%(7/84)和4.76%(4/84)，見表1。

2.3藥敏試驗結果本次分離沙門菌對頭孢類抗生素(頭孢他啶、頭孢吡肟和頭孢噻肟)敏感率達84.21%以上。對于環丙沙星與氯霉素的敏感性在66.67%以上，對于甲氧芐啶與慶大霉素的敏感性50.88%以上。對于ACSSuT耐藥譜中的幾種抗生素，出現氨芐西林(AMP)、鏈霉素(STR)、磺胺甲二唑(SMX)和四環素(TCY)多重耐藥，耐藥率在50%～75%之間，而其中的氯霉素(CHL)仍然相對敏感，但仍有6株鼠傷寒沙門菌出現ACSSuT耐藥譜；有l株腸炎沙門菌13ESS1295和1株韋太夫雷登沙門菌14ESS1286對10種抗生素均耐藥，1種中介。各年齡段的耐藥率并沒有出現大的差異， 見表2。

表1不同血清型沙門菌的所占百分比

Tab.1Percentage of different Salmonella serotypes

血清型(Serotype)菌株量(No.ofstrains)百分比(Ratio/%)鼠傷寒沙門菌(Typhimurium)3642.86腸炎沙門菌(Enteritidis)1315.48斯坦利沙門菌(Stanley)78.33羅森沙門菌(Rissen)78.33韋太夫雷登沙門菌(Weltevreden)44.76德爾卑沙門菌(Derby)22.38倫敦沙門菌(London)22.38豬霍亂沙門菌(Choleraesuis)11.19傷寒沙門菌(Typhi)11.19恩戈爾沙門菌(Ngor)11.19吉韋沙門菌(Give)11.19雷丁沙門菌(Rding)11.19里定沙門菌(Reading)11.19利奇菲爾德沙門菌(litchfield)11.19比斯拉沙門菌(Bsilla)11.19紐波特沙門菌(Newport)11.19圣保羅沙門菌(Saintpaul)11.19湯卜遜沙門菌(Thompson)11.19新斯托夫沙門菌(Sinstorf)11.19印第安納沙門菌(Indiana)11.19

2.4PFGE試驗結果選取分離的鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌種共51株分離株使用限制性內切酶XbaⅠ酶切、PFGE 分型并對電泳結果進行圖譜聚類分型(圖2)。根據菌株間相似性>100%視為同一PFGE型，51株沙門菌經過聚類分析可分為 42個PFGE型，相似度在53%～100%之間。其中32株鼠傷寒沙門菌可分為28個PFGE型，12株腸炎沙門菌可分為10個PFGE型，7株斯坦利沙門菌可分為5個PFGE型。鼠傷寒沙門菌中有3株2012年的菌株PFGE帶型相似性為100%，3株2014年的菌株PFGE帶型相似性為100%；腸炎沙門菌中2012年的ESS12451菌株與2013年的13ESS1294PFGE帶型相似性為100%，2014年的2株菌株PFGE帶型相似性為100%。斯坦利沙門菌的2012年的ESS12828株與2014年的14ESS0992株相似性為100%；2014年的2株菌株PFGE帶型相似性為100%。

3　討　論

據資料統計，在我國細菌性食物中毒中，70%～80%是由沙門氏菌引起[4]，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌(105～106個/g)的食物，就會引起細菌性感染，進而在毒素的作用下發生食物中毒[4]。廣州市屬于亞熱帶氣候，全年7—10月均較為炎熱，有利于沙門菌的增殖，故這幾個月的分離率明顯高于其他月份。從菌種來源人群的年齡結構來看，5歲以下嬰幼兒構成比明顯高于成人，這與嬰幼兒免疫力低下，感染該菌后病情表現嚴重，大多家長均會快速尋求醫治，而當醫生收治嬰兒病患時，常做糞便培養有關。而老年人患病率僅次于嬰幼兒也與其免疫力低下有關。本次分離的沙門菌血清型以鼠傷寒沙門菌為主，其次為腸炎沙門菌和斯坦利沙門菌。該分布與廣東省歷年整體分布保持一致[5-8]，但與中山市的斯坦利沙門菌所占比例高于腸炎沙門菌有區別[9]。

表284株沙門菌不同年齡段藥物敏感試驗結果(%)

Tab.2Antibiotic susceptibility of 84 Salmonella stains in different age groups

age(stain)≤5(57/84)6-20(3/84)20-50(12/84)≥50(12/84)SIRSIRSIRSIRAMP29.820.0070.1833.330.0066.6750.000.0050.0033.330.0066.67CAZ84.213.5112.28100.000.000.0091.678.330.0091.678.330.00CIP71.9317.5410.5366.670.0033.3375.0016.678.3383.3316.670.00CHL68.421.7529.8233.330.0066.6758.3316.6725.0066.678.3325.00CTX84.210.0015.7966.670.0033.33100.000.000.0091.670.008.33FEP87.721.7510.53100.000.000.0091.670.008.3391.670.008.33NAL49.1214.0436.8433.3333.3333.3358.330.0041.6741.670.0058.33SMX24.561.7573.680.000.00100.0016.678.3375.0050.000.0050.00STR19.3022.8157.890.0066.6733.338.3333.3358.3333.3325.0041.67TCY22.811.7575.4433.330.0066.6725.000.0075.0041.678.3350.00TMP54.391.7543.8633.330.0066.6741.670.0058.3366.670.0033.33GEN50.8815.7933.3366.670.0033.3366.670.0033.3358.338.3333.33

注：氨芐西林(AMP)、頭孢他啶(CAZ)、環丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢毗肟(FEP)、萘啶酸(NAL)、磺胺甲二唑(SMX)、鏈霉素(STR)、四環素(TCY)和甲氧芐啶(TMP)慶大霉素(GEN).

S：敏感(Susceptible) I：中介(Intermediate)R：耐藥(Resistant)

圖2　51株沙門菌PFGE聚類分析圖譜(XbaⅠ內切酶)Fig.2　Cluster analysis of 51 stains of Salmonella according to the results of PFGE incised by XbaⅠ

在本次耐藥率分析中出現6株鼠傷寒沙門菌存在ACSSuT耐藥譜；有l株腸炎沙門菌13ESS1295和1株韋太夫雷登沙門菌14ESS1286對10種抗生素均耐藥，1種中介。對AMP的耐藥率相較于往年[5]有大幅上升，達到66%以上。對頭孢毗肟(FEP)的敏感率也下降到90%左右。提示本地區引起腹瀉的沙門菌耐藥性變得更加嚴峻，這與世界范圍的沙門菌耐藥趨勢相同[10]，需要臨床醫生的重視，在早期經驗性用藥的基礎上，根據藥敏結果合理使用抗生素。

近年來，隨著基因測序技術的快速發展，對各種流行菌株監測的方法逐步發生改變，然而PFGE分型技術仍被廣泛地應用于我國各級別疾控中心對細菌的分子流行病學研究，其優點具有能夠對整個染色體進行分析、重復性好、易于標準化等[11]。在本次研究中，51株沙門菌經過聚類分析可分為42個PFGE型，相似度在53%～100%之間，表現為較大的遺傳多樣性。對于相似度100%的菌株溯源及病例分析，并沒有同源性暴發的證據，且這些菌株的耐藥譜并不存在明顯關聯性，這可能是由于菌株耐藥基因發生突變位點并不在以XbaⅠ為酶切基礎的PFGE 酶切位點上，導致耐藥情況無法從分型中表現出來。

對PFGE結果的分析，不同研究者可出現較大差異。Tenover等在解釋PFGE結果時，將具有85%以上相同條帶的菌株認為是相同的菌株，50%以上的條帶不相同時，菌株被認為流行病學不相關。這是因為細菌存在高度變異性，他們認為在判斷是否同一菌株時允許存在一定的變異[12]。這一觀點在現在的一些畜牧業食源性肉類研究中被使用[11]。因此，在基因技術高速發展的背景下，更加精確標準化的溯源監測方案亟待完善。

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Characterization of antimicrobial resistances and molecular characteristics of 84 strains ofSalmonella

LIN Mao-rui，ZHOU Xuan，LI Ming-you，HUANG Ji-wei，LIU Gui-zhi，CAO Dong-lin

(Departmentoflaboratory,thesecondPeoplesHospitalofGuangdong,Gungzhou510317,China)

A total of 84Salmonellaisolates，from part of Guangzhou，2012-2014，were detected with serum agglutination and antibiotic susceptibility to investigate the antimicrobial resistance. Results were assessed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI，2012). The 51Salmonellastrains were tested by pulse field gel electrophoresis (PFGE). Bionumerics software was used to analyze the PFGE results in order to determine the correlation between differentSalmonellastrains. Results showed thatSalmonellainfections were found in all age groups and children under 5 years old accounted for the major proportion (67.86%)，with the gender ratio at 1.1∶1. A total of 84Salmonellastrains were divided into 20 serotypes. The top three wereSalmonellatyphimurium(42.86%)，Salmonellaenteritidis(15.48%) andSalmonellastanley(8.33%). Over 84.21% ofSalmonellawere sensitive to Cephalosporin，66.67% to Ciprofloxacin (CIP) and Chloramphenicol (CHL)，50.88% to Trimethoprim (TMP) and Gentamicin (GEN). However，there still were many strains showed multidrug resistance. The 51Salmonellastrains were divided into 42 PFGE types，showing great genetic diversity. We emphasized that antibiotics should be chosen reasonably and prudently based on antimicobial sensitivity testing. There is no significant correlation betweenSalmonellaresistance patterns and PFGE types in our survey.

Salmonella; antimicrobial resistance; pulsed-field gel electrophoresis

Cao Dong-lin，Email: caodl@126.com

曹東林，Email：caodl@126.com

廣東省第二人民醫院檢驗科，廣州510317

R378.2

A

1002-2694(2016)06-0553-05

2015-08-13；

2015-12-22

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.009

廣東省醫學科學技術研究基金(No.C2012036)和2013年度廣東省級財政技術研究開發與推廣應用專項資金(粵財工[2013]401號)聯合資助