MTT試驗檢測EV71 2A蛋白對宿主細胞損傷作用

喬　喬,李　靜,張文強,馬英偉,莊志超,白永娟,趙　麗,王志玉,溫紅玲

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MTT試驗檢測EV71 2A蛋白對宿主細胞損傷作用

喬喬1,李靜1,張文強2,馬英偉1,莊志超1,白永娟1,趙麗1,王志玉1,溫紅玲1

目的在Vero細胞、RD細胞和U87細胞3種細胞系中，研究EV71的2A蛋白對宿主細胞增殖能力的影響及對細胞的損傷作用，揭示2A蛋白在EV71的致病機制中所起的作用。方法將野毒株EV71 SDLY 107株(強毒株)、EV71 SDLY 1株(弱毒株)和嵌合毒株EV71 SDLY 107-2A-1感染Vero細胞、RD細胞、U87細胞后，利用MTT試驗測定3種細胞在感染病毒后不同時間點的存活情況，繪制細胞生長曲線，比較細胞增殖程度，并利用單因素方差分析法分析3種細胞在感染不同病毒48 h后的存活率；結果EV71 SDLY 107株感染Vero細胞和RD細胞后細胞增殖程度和存活率均低于EV71 SDLY 1株(t=41.64，P<0.001；t=33.28，P<0.001)；EV71 SDLY 107-2A-1嵌合株感染Vero細胞和RD細胞后，細胞增殖程度和存活率均高于親本病毒EV71 SDLY 107株，低于EV71 SDLY 1株(t=17.97，P<0.001；t=42.09，P<0.01)； EV71 SDLY 107-2A-1株感染U87細胞后細胞存活率低于EV71 SDLY 1株(t=8.85，P<0.001)，但與EV71 SDLY 107株感染后細胞存活率無統計學差異(t=0.74，P=0.603)；不同細胞感染同株病毒48 h后，U87細胞存活率均為最低，Vero細胞存活率均為最高。結論EV71強毒株的2A蛋白對細胞產生的損傷作用大于弱毒株的2A蛋白，提示2A蛋白在EV71對宿主細胞的作用中發揮功能。

EV71；2A蛋白；細胞增殖；存活率

腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是小RNA病毒科腸道病毒屬成員，可引起重癥手足口病，常伴有神經系統并發癥[1-4]，其基因組是一條單股正鏈RNA，只有一個開放閱讀框架(ORF)。非結構蛋白2A(2Apro)是由150個氨基酸組成的半胱氨酸水解蛋白酶，可水解前體蛋白P1與P2之間的肽鍵[5]，并切割3CD產生3C′和3D′蛋白[6-7]。EV71 2Apro具有轉錄激活性質[8]，并可通過分解eIF4G和PARP誘導宿主細胞凋亡[9-11]。目前研究均說明2A蛋白在EV71的復制過程及毒力作用中可能具有重要意義，但尚有許多問題有待闡明。

本研究利用反向遺傳操作構建了EV71的2A嵌合病毒，在3種不同的細胞系中分別感染EV71的強毒株、弱毒株和嵌合毒株，檢測不同毒株對細胞的損傷作用和對細胞的增殖能力影響，旨在探討強弱毒株2A蛋白對EV71細胞損傷的差異和對細胞增殖能力影響，為進一步研究2A蛋白的功能和作用機制提供研究基礎。

1　材料和方法

1.1細胞和病毒非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)和人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87細胞)為本室保存，橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)為山東省疾病預防控制中心惠贈。EV71 SDLY 107野毒株為本室分離自1例HFMD 合并腦炎的死亡患兒咽拭子標本，EV71 SDLY 1株為本室分離自1例單純HFMD患兒糞便標本，病毒分離所用細胞為RD細胞[12]。嵌合體病毒SDLY 107-2A-1株為在SDLY 107全長cDNA感染性克隆基礎上將2A蛋白置換為弱毒株SDLY 1株的2A片段構建而成，為本室構建鑒定并保存[13]。

1.2主要儀器與試劑MTT(北京Solarbio公司)、PBS(北京Solarbio公司)、二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)，DMEM( 美國Hyclone公司)，0.25%胰酶(北京中科邁晨科技有限公司)，胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，酶標儀(美國BioTek公司)。

1.3病毒培養與收集將EV71 SDLY 107株、EV71 SDLY 1株、EV71 SDLY 107-2A-1株病毒分別接種于RD細胞中，置于37 ℃ 5% CO2條件下培養至約90%細胞病變時，置于-40 ℃反復凍融3次后，10 000 r/min離心10 min，取上清分裝后于-80 ℃保存，并測定病毒滴度[2]。

1.4MTT試驗配制MTT使用液(5 mg/mL)：將250 mg的MTT粉末用1×PBS溶解并定容至50 mL，分裝于1.5 mL離心管中，避光保存于-20 ℃備用。在37 ℃ 5% CO2條件下，用含8%胎牛血清的DMEM在96孔板中分別培養Vero細胞、RD細胞和U87細胞，待細胞生長至70%～90%良好單層時，接種這4種病毒(MOI=0.001)，同時設置調零孔(培養液、MTT、DMSO)，對照孔(細胞、培養液、MTT、DMSO)，每個樣品和對照均設3個平行樣。在細胞感染病毒0 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，吸棄上清，每孔加入90 μL含1%胎牛血清的DMEM和10 μL的5 mg/mL MTT溶液后，置于37 ℃ 5% CO2條件下培養4 h后，吸棄上清，每孔再加入110 μL的DMSO，置于37 ℃ 10 min至紫色結晶完全溶解后，利用酶標儀在490 nm處測其吸光度值(A值)，繪制感染病毒后不同細胞的生長曲線，比較細胞存活率的差異。在細胞感染病毒48 h后，重復3次上述實驗，按公式(實驗組A值-調零孔A值)/(對照組A值-調零孔A值)計算出細胞存活率，利用單因素方差分析法進行統計學分析。

1.5統計學方法利用SPSS16.0軟件進行統計學分析，不同處理組間比較采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)，若方差齊再利用LSD法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05，P<0.05有統計學意義。

2　結　果

2.1病毒感染后細胞的生長曲線EV71 SDLY 107株、EV71 SDLY 1株、EV71 SDLY 107-2A-1株病毒接種Vero細胞、RD細胞和U87細胞，培養24 h后，均可觀察到明顯的細胞病變效應(CPE)，在0 h～48 h內每隔12 h分別檢測吸光度值(A值)，并繪制細胞生長曲線。由細胞生長曲線可知，在Vero細胞和RD細胞中(圖1A、1B)，EV71 SDLY 107-2A-1株感染后0～48 h內細胞增殖程度高于EV71 SDLY 107株，但低于EV71 SDLY 1株，感染組細胞增殖程度均低于對照組；在U87細胞中(圖1C)，EV71 SDLY 107株、EV71 SDLY 1株及EV71 SDLY 107-2A-1株感染后細胞生長曲線無明顯差異，感染組細胞增殖程度均低于對照組。

A.Vero細胞；B.RD細胞；C.U87細胞A. Vero cells; B. RD cells; C. U87 cells圖1　細胞生長曲線Fig.1　Cell growth curves

2.2不同病毒感染同種細胞對細胞存活率的影響分析Vero細胞、RD細胞和U87細胞分別感染3株病毒48 h后，MTT實驗檢測細胞存活率，重復3次實驗，利用單因素方差分析可知，在Vero和RD細胞中(圖2A、2B)，EV71 SDLY 107-2A-1嵌合株感染后48 h的細胞存活率高于強毒株EV71 SDLY 107株(t=15.54,P<0.09;t=4.96,P<0.001)，低于弱毒株EV71 SDLY 1株(t=17.97,P<0.001;t=42.09,P<0.001)，差異有統計學意義；而在U87細胞中(圖2C)，EV71 SDLY 107-2A-1嵌合株與強毒株EV71 SDLY 107株感染后的細胞存活率無統計學差異(P=0.74,P=0.603)，但EV71 SDLY 107-2A-1株(t=8.85,P<0.001)與EV71 SDLY 107株(t=8.96,P<0.001)感染后細胞存活率都低于EV71 SDLY 1株，差異有統計學意義。

2.3同株病毒感染不同細胞對細胞存活率的影響分析細胞感染3株EV71病毒后，U87細胞存活率均為最低，Vero細胞存活率均為最高；EV71 SDLY 107株感染3種細胞48 h后，細胞存活率均低于50%；EV71 SDLY 1株感染U87細胞后細胞存活率顯著低于Vero細胞(t=20.48,P<0.001)和RD細胞(t=15.58,P<0.001)，差異有統計學意義；EV71 SDLY 107-2A-1嵌合株感染細胞48 h后，Vero細胞存活率高于RD細胞，且RD細胞存活率高于U87細胞(t=7.11,P<0.001)，差異有統計學意義。

A. Vero細胞存活率；B. RD細胞存活率；C. U87細胞存活率A. Survival rates of Vero cells; B. Survival rates of RD cells; C. Survival rates of U87 cells.圖2　不同病毒感染同種細胞48h的細胞存活率Fig.2　Survival rates of cells at 48 h post-infection by different virus

圖3　同株病毒感染不同細胞48 h后的細胞存活率Fig.3　Survival rate of different cells at 48 h post-infection by the same virus

3　討　論

本實驗室的前期研究表明，強毒株EV71 SDLY 107株和弱毒株EV71 SDLY 1株在RD細胞中的復制能力和對細胞感染力存在明顯差別，但機制不明。我們對EV71 SDLY 107株和EV71 SDLY 1株的蛋白序列進行比對，發現2株病毒在2A蛋白上的64、68和75位氨基酸不同，由于2A蛋白具有轉錄活性和酶活性，推測2A蛋白上氨基酸位點的區別可能是引起EV71 SDLY 107株和EV71 SDLY 1株的復制差異和感染性差異不同的原因，也有可能是影響EV71毒力表型的重要原因之一。我們利用反向遺傳技術對強毒株EV71 SDLY 107株和弱毒株EV71 SDLY 1株的2A蛋白進行了置換，成功構建了EV71嵌合體病毒的感染性克隆，并成功拯救出EV71 SDLY 107-2A-1嵌合株[13]，為我們在全病毒水平上檢測EV71 2A蛋白的功能提供了研究基礎。

本研究利用MTT試驗對病毒致細胞增殖抑制的作用進行了研究，結果表明，EV71 SDLY 107株對Vero細胞和RD細胞的損傷作用明顯高于EV71 SDLY 1株，但在U87細胞中這2株病毒致細胞損傷作用差異較小，這可能是由于EV71對神經膠質瘤細胞過于敏感，不同毒力表型的毒株對U87細胞的損傷作用都很強，并不能通過MTT試驗檢測出來，這也從另一個角度說明了EV71對神經系統的致病性，但是實驗中所用的EV71 SDLY 1分離株并未在臨床上表現出明顯的神經癥狀，這可能是由于EV71的神經毒力機制是由多個因素共同決定的。EV71不同毒株都對U87細胞高度敏感，因此U87細胞可以作為研究EV71毒力的細胞系。此外，分別比較3株病毒感染不同細胞系后可得出，Vero細胞的存活率最高，U87細胞的存活率最低，RD細胞存活率介于二者之間，這可能是由于EV71具有嗜神經性，因此對于U87細胞的損傷作用最強，這可能與細胞上的受體分布有關，在U87細胞上存在某種特異性病毒受體，更有利于EV71對細胞的感染。由此可以推斷，2A蛋白在2株親本毒株致細胞損傷作用差異中發揮了一定的作用。除此之外，EV71 SDLY 107株和EV71 SDLY 1株的2A蛋白有3個氨基酸位點的差異，這對我們利用定點突變技術進一步研究2A蛋白上的潛在的神經毒性關鍵氨基酸位點具有重要意義。

本研究利用反向遺傳技術，在全病毒水平上對EV71 2A蛋白在不同毒株和不同細胞系中致細胞損傷作用進行了研究，這為RNA病毒的結構蛋白及非結構蛋白的研究開辟了新途徑。在EV71全病毒水平上進行的蛋白功能研究比在體外表達蛋白進行功能研究更加具有說服力和實際意義，在此基礎上，還可以通過建立動物模型進一步研究2A蛋白在病毒復制能力和毒力中起到的作用，為EV71致病機制的研究及抗病毒藥物和疫苗的研制奠定了研究基礎。

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Host cell injuries caused by 2Aproof EV71 detected by MTT assay

QIAO Qiao1, LI Jing1, ZHANG Wen-qiang2, MA Ying-wei1, ZHUANG Zhi-chao1,BAI Yong-juan1, ZHAO Li1, WANG Zhi-yu1, WEN Hong-ling1

(1.DepartmentofVirology,SchoolofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,China2.ShandongCenterforDiseaseControlandPrevention,Jinan250014,China)

We studied host cell proliferations and injuries caused by 2Aproof EV71 in Vero cells, RD cells and U87 cells and to reveal the role of 2Aproin EV71 pathogenic mechanism. Vero cells, RD cells and U87 cells were infected by wild strains EV71 SDLY 107 (EV71 fatal strain), EV71 SDLY 1 (EV71 mild strain) and chimeric strain EV71 SDLY 107-2A-1, the survival of three cell lines at different time post infected by viruses were detected used by MTT assay, the cell growth curves were drew to compare cell proliferation and the survival rates of three cell lines at 48 hours post infected by different viruses were analyzed by ANOVA. Results showed that cell proliferations and survival rates of Vero cells and RD cells infected by EV71 SDLY 107 were lower than EV71 SDLY 1 (t=41.64,P<0.001;t=33.28,P<0.001). The proliferations and survival rates of Vero cells and RD cells post-infected by EV71 SDLY 107-2A-1 were higher than that in EV71 SDLY 107 and lower than that in EV71 SDLY 1 (t=17.97,P<0.001;t=42.09,P<0.001). The survival rate of U87 cells infected by EV71 SDLY 107-2A-1 was lower than that in EV71 SDLY 1 (t=8.85,P<0.001) and no different than that in EV71 SDLY 107 (t=0.74,P=0.603). U87 cells had the lowest survival rate and Vero cells had the highest survival rate at 48 h post infected by the same virus strain. The 2Aproof virulent strain caused more severe cell injury than 2Aproof attenuated virus, which reveals 2Aproplays a role in the effect of EV71 on host cells.

EV71; 2Apro; cell proliferation; survival rate

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81371833) and the Medical and Health Science and Technology Development Plan of Shandong Province (No. 2013WS0211)

Wen Hong-ling, Email: wenhongling@sdu.edu.cn

溫紅玲，Email: wenhongling@sdu.edu.cn

1.山東大學公共衛生學院病毒學研究室，實驗畸形學教育部重點實驗室，濟南250012；2. 山東省疾病預防控制中心，濟南250014

R373.2

A

1002-2694(2016)06-0525-04

2015-10-08；

2016-03-28

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.004

國家自然科學基金面上項目(No.81371833)和山東省醫藥衛生科技發展計劃(No.2013WS0211)聯合資助