人G1型輪狀病毒TaqMan熒光定量檢測方法的建立與應用

彭　杰，胡曉星，馮　悅，甸子芩，孫　鷖，牛　華，夏雪山

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人G1型輪狀病毒TaqMan熒光定量檢測方法的建立與應用

彭杰1,2，胡曉星2，馮悅2，甸子芩1，孫鷖1，牛華1，夏雪山2

目的本研究旨在建立一種快速準確定量檢測人G1型輪狀病毒的TaqMan探針熒光實時PCR檢測方法。方法以輪狀病毒VP6基因為靶基因，分別設計2對引物及其相應的TaqMan探針，擴增目的片段，將目的片段克隆于PCDNA3.1+載體上，體外轉錄獲得RNA，系列稀釋后為標準品，建立TaqMan探針熒光定量實時PCR檢測方法并對該方法進行驗證。結果設計實驗找到最優條件下的引物濃度(250 nmol/L)、探針濃度(300 nmol/L)；通過對引起腹瀉的人柯薩奇病毒、呼腸孤病毒等進行檢測，結果均為陰性，表明該方法具有很好的特異性。該方法的最低檢測量為5 copies/μL。對該方法進行重復性實驗，發現變異率均小于1%，重復性好。用已建立的方法對4份糞便臨床樣品進行3次重復試驗，病毒RNA的檢出率為100%。結論本實驗初步建立了人G1型輪狀病毒TaqMan探針熒光實時PCR檢測方法，為G1型輪狀病毒的診斷、檢測和分子流行病學研究提供了一種新的方法。

人輪狀病毒；VP6基因；TaqMan熒光定量PCR

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輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，是一種由11條不連續的雙鏈RNA片段構成的無包膜病毒，外層由3層蛋白殼包被(外衣殼，內衣殼，核衣殼)。輪狀病毒感染及其引起的腹瀉病遍及全球各地，是導致全球嬰幼兒腹瀉和死亡率最高的病原體[1]。輪狀病毒顆粒共由6個結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6與VP7)和6個非結構性蛋白質(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5與NSP6)構成。外殼蛋白VP7 (G糖蛋白)具有抗原活性，能刺激機體產生中和抗體，對機體免疫有重要作用。VP7是輪狀病毒血清學分型的重要依據，根據VP7特異性的不同，將輪狀病毒分為14個G血清型，其中G1、G2、G3、G4和G9血清型是世界各地比較常見的流行株[2]。中國2001年以前，G1血清型為主要流行株，占67．1%～83．4%，雖然2001年之后流行的以G3型為主，G1型仍然占有25%的比例，不同地區流行情況也不盡相同，以廣東地區為例，1998-2001年G1血清型占84．1%，G3血清型占6．8%；2007-2008年G3血清型成為流行株，占48．1%，G1血清型下降為33．3%；2008-2009年G1血清型上升為52.4%[3]，由于G1型輪狀病毒感染的多樣性，因此，對G1型輪狀病毒腹瀉的長期監測顯得格外重要。

目前，輪狀病毒的主要檢測方法包括病變檢測、ELISA、PAGE電泳以及RT-PCR。由于某些類型的RV所致細胞病變不明顯，使得病變檢測方法產生較多假陰性；ELISA受到主觀因素影響較大，出現假陽性概率較大；PAGE的靈敏性不高且不能保證RNA的完整性；常規的RT-PCR易污染且不能定量。熒光定量PCR技術作為一種新型的分子檢測技術,可通過實時監測熒光信號積累對未知樣本中病毒載量進行準確定量,不僅操作快捷簡便，具有高度靈敏度和特異性,而且可防止傳統PCR普遍存在的污染問題,在病原體檢測中具有良好的應用前景。

輪狀病毒VP6基因編碼的蛋白占編碼病毒蛋白總量的51%，在不同血清型間具有高度保守性(87%～99%)[4]，VP6蛋白在輪狀病毒感染的診斷上是一個重要的檢測指標[5-6]。因此，本實驗針對G1型輪狀病毒VP6基因設計引物和探針，以輪狀病毒G1型WA株型為標準株構建標準品，優化反應體系，建立輪狀病毒G1型熒光定量PCR檢測方法，為擴大G1型輪狀病毒的監測范圍，提高分子流行病學的監測力度，掌握腹瀉的動態流行特征奠定了方法學基礎。

1　材料和方法

1.1病毒株和細胞株人輪狀病毒(HRV-WA株)和羅猴胚胎腎細胞(MA-104)均購自中國典型培養物保藏中心，呼腸孤病毒和柯薩奇A16病毒由本實驗室保存。

1.2標準品的構建在GenBank中下載HRV-WA株的所有vp6基因序列，用MEGA6進行序列比對，選取同源性好的片段，用Primer premier5.0軟件設進行引物設計，引物信息參見表1。引物由大連寶生物公司合成。

表1用于構建PC-VP6載體的外圍引物

Tab.1The external primer used to construct a PC-VP6 vector

引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')位置site大小size/bpTM/℃F-AGGAAGCTTGTATG-TATGGATGAAATGGC305-3252153.4R-AGGGAATTCTAATG-GAAGCTACCGTGAAA1178-11972053.7

注：下劃線部分分別為HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點

Note: The nucleotide underlined representingHindⅢ andEcoRⅠ

以提取的人輪狀病毒RNA為模板，擴增目的基因，擴增產物大小為893 bp，目的基因和PCDNA3.1+載體用HindⅢ和EcoRⅠ進行酶切、T4連接酶連接后轉化到感受態細胞JM-109中進行擴增；篩選陽性克隆子并進行純化。將克隆好的質粒，用大連寶生物公司DNA純化試劑盒進行純化，純化完成后用大連寶生物公司T7體外轉錄酶進行體外轉錄，并對轉錄完成的RNA進行RNA純化并測其OD值，將已知拷貝數的RNA按照合適的稀釋倍數，利用優化的熒光定量PCR反應條件，進行實時PCR反應，建立Ct/LogCopynumber工作曲線。

1.3TaqMan PCR檢測體系的建立

1.3.1TaqMan PCR引物和探針的設計根據目的基因893 bp的序列，利用Primer express3.0設計引物和探針，引物和探針均由大連寶生物公司合成，引物和探針序列見表2。

表2HRV TaqMan RT-PCR引物和探針

Tab.2TaqMan RT-PCR primer and probe of HRV

引物/探針primersandprobes序列位置site大小size/bpTM/℃FTTATTATTTCAGTTGAT-GCGTCCA891-9142459.7RTGCTAACAGAGTTTCAT-TTGCG1034-10552258.6PFAM-TCCACAAGCACAAC-CTTTTCAGCACC-TAMRA947-9722670.4

注：根據HRV-VP6基因序列設計而成

Note:The primer was designed based on the HRV-vp6 gene

1.3.2試劑系統的選擇，引物、探針濃度的優化根據One Step PrimeScript RT PCR Kit(TaKaRa，RR064A)說明書，在20 μL的體系中分別加入ExTaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，探針(5 μmol/L)0.8 μL，2×OneStepRT-PCRBufferⅢ 10 μL，模板RNA 5 μL補加RNase Free dH2O至20 μL。擴增程序為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；45個循環。固定引物濃度分別用200、300和400 nmol/L的探針濃度按照如上體系反應，固定探針濃度分別用200、250和300 nmol/L的引物濃度按照如上體系反應，以ΔRN值最大且所用的引物和探針濃度最小為評判標準。

1.4TaqMan PCR檢測方法的評價

1.4.1方法特異性分析分別以輪狀病毒、呼腸孤病毒、柯薩奇病毒A16為模板，按照20 μL最佳反應體系，按照42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，45個循環進行反應。

1.4.2方法靈敏性分析將已知拷貝數的RNA進行10倍梯度稀釋，選取107～100 copies/μL 8個濃度的RNA為模板，以優化的熒光定量PCR反應條件進行反應。以CT值>35個循環為下限檢測該體系的靈敏性。

1.4.3方法重復性、穩定性分析該體系的重復性和穩定性從批間和組間2個方面來設計實驗進行驗證。

批間：不同批次間配置的109～103copies的RNA標準品，各批間不同時間檢測3次(每5 d一次)，分別計算他們各自曲線相關系數的變異系數。

組間：選取108、106、104拷貝的3個不同濃度的定量標準品，分別進行3次重復，計算他們各自的CT值變異系數。

1.5熒光定量PCR的初步應用收集臨床糞便樣品，用PBS溶解后3 000 r/min,離心30 min，收集上清并提取RNA,取4份樣品的RNA,每份做3個重復，用已經建立的TaqMan熒光定量PCR方法對其進行檢測并對結果進行分析。

2　結　果

2.1外參的構建

2.1.1PC-VP6克隆載體的構建與鑒定經PCR獲得的目的片段用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得WA標準株型的特異性條帶(893 bp)(見圖1)。目的基因和PCDNA3.1+載體用HindⅢ和EcoRⅠ進行酶切、T4連接酶連接后轉化到感受態細胞JM-109中進行擴增；篩選陽性克隆子并進行純化，并對陽性克隆進行雙酶切驗證，結果如圖2所示。

圖1　目的基因電泳結果圖Fig.1　The PCR result of target gene

注:1和2為克隆載體雙酶切驗證結果，3為未經酶切的對照載體Note：1,2: Digested product of cloning vector,3: undigested product of cloning vector圖2　克隆載體雙酶切驗證結果Fig.2　Digested product of cloning vector

2.1.2克隆載體體外轉錄后RNA拷貝數的確定 對克隆好的PC-VP6克隆載體進行體外轉錄并將獲得的RNA進行純化，采用紫外分光光度計測其OD值為294 ng/μL。根據公式：拷貝數(copise/μL)=質粒濃度(g/μL)×阿式常數/RNA分子量。阿式常數為6.02×1023，RNA分子量=一個堿基的分子量(340)×重組RNA總長度(bp),測得拷貝數為5×1011copies/μL。

2.2TaqMan方法的建立與優化

2.2.1試劑系統的選擇，引物、探針濃度的優化實驗結果表明，本實驗最優的反應體系為ExTaqHS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，探針(5 μmol/L)1.2 μL，2×One Step RT-PCRBufferⅢ 10 μL，模板RNA 5 μL補加RNase Free dH2O至20 μL。擴增程序為：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；45個循環。

2.2.2TaqMan PCR工作曲線的建立將拷貝數為5×1011copies/μL的RNA樣品進行10倍梯度稀釋，以5×109～5×103copies/μL為模板繪制標準曲線，以標準品稀釋拷貝數為橫坐標以PCR反應的循環數(CT)為縱坐標，建立TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線，其線性回歸方程為y=-3.585x+43.526,標準曲線斜率為-3.585，R2=0.999擴增效率為EFF=90.092%.說明PCR擴增該標準品的效率高，線性關系和準確度良好，符合PCR反應標準曲線的要求，結果見圖3。

圖3　TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線Fig.3　Standard curve of TaqMan real-time PCR

2.3TaqMan方法的評價

2.3.1特異性分析分別用同為兒童呼吸道傳播且引起兒童腹瀉的輪狀病毒、呼腸孤和柯薩奇A16病毒進行TaqMan熒光定量PCR反應，從圖4中發現，只有輪狀病毒具有良好的擴增曲線，表明該對引物用于檢測輪狀病毒具有良好的特異性。

圖4　TaqMan PCR方法特異性分析結果圖Fig.4　Specific analysis of quantitative PCR

2.3.2靈敏性分析將已知拷貝數的RNA進行10倍梯度稀釋，以5×107～5×100copies/μL 8個濃度的RNA為模板，以優化的熒光定量PCR反應條件進行反應。通過擴增曲線可知，5×100copies/μL RNA的擴增CT值>35個循環，表明該檢測體系可以檢測到5×100copies/μL(圖5)。

圖5　TaqMan PCR方法靈敏性分析結果Fig.5　Sensitivity analysis of quantitative PCR

2.3.3重復性和穩定性分析從批間和組間2個方面來設計實驗進行驗證，批間重復性分析結果不同批次間配置的5×109～5×103copies的RNA標準品，各批間不同時間檢測3次(每5 d一次)，測得他們的相關系數R2分別為0.995、0.999、0.995、0.997、0.995、0.996。計算出他們的平均值和標準差(s)分別為0.995 5和0.001 8，進而得到批間重復的變異系數CV=0.181%,小于0.5%，該體系的批間重復性和穩定性良好(見表3)。

表3熒光定量PCR批間重復試驗

Tab.3Inter variation of quantitative PCR

Group(Lot-Day)R2SCV1-10.9950.00180.181%1-50.9991-100.9952-10.9972-50.9952-100.996

表4熒光定量PCR組間重復試驗

Tab.4Intra variation of quantitative PCR

CopiesCtValuex s CV10814.9514.9715.0714.950.050.35%10622.5822.4022.0822.350.250.94%10429.3929.5628.9129.280.280.96%

圖6　熒光定量PCR組間重復試驗Fig.6　Intra variation of quantitative PCR

表5TaqMan熒光定量PCR方法臨床樣品檢測結果

Tab.5Clinical samples test results using TaqMan real-time fluorescent RT-PCR

nCtValuex s CV115.6516.0915.9115.880.1810.010%230.8230.9730.9630.920.0690.002%330.9830.9530.8430.920.0790.003%431.3231.4231.2831.340.0590.001%

3　討　論

針對輪狀病毒已經建立了多種檢測技術，以免疫學檢測技術最為常用，該技術是WHO推薦的免疫檢測技術，可靠性和實用性較高。其中,ELISA方法具有操作簡便,價格低廉,靈敏度和特異度高,無放射性污染,無需特殊儀器等特點而廣泛應用，但該方法的主觀因素影響較大，出現假陽性概率較大。普通PCR技術，雖然簡單快速，但其特異性以及靈敏度不夠，容易造成污染。本實驗建立的TaqMan熒光定量PCR方法，相對于電鏡檢測，TaqMan熒光定量PCR針對輪狀病毒vp6基因進行檢測，可以避免因病毒顆粒降解而造成的誤診，且定量PCR儀價格適中，更適合推廣。相對于ELISA的主觀性較大且假陽性較高，熒光定量PCR對引起腹瀉的呼腸孤和柯薩奇進行特異性檢測，發現其他病毒均為陰性，表明該檢測方法具有很好的特異性，且熒光定量PCR的批內和批間變異系數均小于1%，說明該方法具備很好的穩定性。熒光定量PCR最低檢測病毒拷貝數為5copies/μL，靈敏度遠遠高于ELISA和普通PCR。熒光定量PCR特異性更強,自動化程度更高,為RV的診斷、檢疫、食品安全檢驗和病原生物學、分子流行病學研究提供了一種新的方法，逐漸得到普及推廣[7-8]。

輪狀病毒熒光定量PCR檢測技術多是SYBR Green I 染料提供熒光信號、檢測靶基因主要是變異性較高的VP7基因[9-10]、標準品主要以DNA為主[9-11]。本實驗采用高特異性的TaqMan熒光探針，針對VP6基因，采用RNA為標準品建立人輪狀病毒熒光定量PCR檢測方法。TaqMan熒光探針法較SYBR Green法的特異性、靈敏性以及準確性都要高，采用TaqMan熒光探針使得檢測的可信度大大提高。Green K等[12]的研究確定了VP7氨基酸序列中存在9個高變區(VRl～VR9)，這表明VP7基因易發生變異，而VP6基因編碼全場為1 356 bp，具有單一的開放閱讀框，編碼397個氨基酸，不同于VP7蛋白，作為群共同抗原的VP6蛋白具有高度保守性，因此也具有高度的抗原交叉反應性。作為RV 重要的組抗原和亞組抗原，在病毒感染的早期就開始合成，參與大部分病毒顆粒的組裝[13]，因此VP6基因更適合輪狀病毒的早期檢測。目前大部分熒光定量檢測方法的標準品是DNA,在樣本提取過程中需要把RNA逆轉錄成DNA再進行定量，在逆轉錄過程中試劑的選擇和操作都將導致實驗的誤差，不僅操作繁瑣，還大大增加了實驗的誤差，實驗的可信度降低。本實驗，采用RNA作為標準品，TAKARA一步法定量試劑盒，減少了實驗步驟，降低了實驗誤差，得到的結果更直觀可信。

目前國內雖然己經發展了輪狀病毒疫苗,但針對G1型輪狀病毒的疫苗還尚未出現。因此對G1型輪狀病毒的預防監測將是公共衛生工作的長期任務,這一工作的開展離不開快速、準確的RV檢測技術。本研究采用標準曲線絕對定量的方法,利用TaqMan探針技術,建立了針對人輪狀病毒G1型VP6基因的熒光定量RT-PCR檢測方法,用于RV拷貝數定量分析,可對臨床樣本進行快速、大批量檢測,為擴大G1型輪狀病毒的監測范圍，提高分子流行病學的監測力度提供了技術支持。

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Establishment and application of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR for G1 serotype rotavirus detection

PENG Jie1,2, HU Xiao-xing2, FENG Yue2, DIAN Zi-qin1,SUN Yi1，NIU Hua1, XIA Xue-shan2

(1.TheAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650034,China2.KunmingUniversityofScienceandtechnology,facultyoflifescienceandtechnology,YunnanProvincialresearchcenterofmolecularmedicine,Kunming650034,China)

The aim of this study is to develop a method of TaqMan real-time PCR for quantitative detection on G1 serotype human rotavirus. Based on theVP6 gene, a set of primer and TaqMan probe were designed. TheVP6 gene fragment was amplified and cloned into the PCDNA3.1+vector. RNA was transcribedinvitroand serial diluted to establish the external standards. With the optimization for PCR parameters, the optimized primer concentration was determined as 250 nM and probe concentration as 300 nmol/L. The human coxsackievirus and reovirus couldn’t be detected which proved the high specificity of this method. The low limitation of this method was detected to be less than 5 copies/μL, and variation coefficient less than 1%. With the 3 times repeated detection on 4 clinical samples, this method was verified to have the good performance. Finally, a TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR for human rotavirus detection was established, which may provide a new approach for the RV diagnosis, food safety inspection and epidemiological investigation.

human rotavirus;VP6 gene; TaqMan fluorescence quantitative PCR

Niu Hua, Email: nh_ynccl@163.com

牛華，Email：nh_ynccl@163.com

1.昆明理工大學醫學院，昆明理工大學附屬醫院，昆明650500;2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南省分子醫學研究中心，昆明650500

R373文獻識別碼：A

1002-2694(2016)06-0512-06

2015-09-14；

2016-03-03

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.002

國家科技支撐計劃項目(No.2014BAI01B01)