AP631炭疽噬菌體裂解蠟樣芽胞桿菌的發(fā)現(xiàn)和鑒定

張慧娟, 劉東立, 賀　莉, 李　偉，張恩民，魏建春，紀(jì)建軍，徐蘇麗，劉　瑋， 張發(fā)信，馬國柱，石　一，馬　琳，梁旭東

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AP631炭疽噬菌體裂解蠟樣芽胞桿菌的發(fā)現(xiàn)和鑒定

張慧娟1, 劉東立2, 賀莉3, 李偉1，張恩民1，魏建春1，紀(jì)建軍3，徐蘇麗3，劉瑋3， 張發(fā)信3，馬國柱2，石一2，馬琳2，梁旭東1

目的AP631炭疽噬菌體裂解蠟樣芽胞桿菌的發(fā)現(xiàn)和鑒定。方法通過革蘭氏染色、菌落形態(tài)特征、噬菌體裂解試驗(yàn)、青霉素敏感試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)對炭疽疫點(diǎn)現(xiàn)場分離的5株菌進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌的鑒定，通過PCR擴(kuò)增、小白鼠毒力測定試驗(yàn)和MLST基因檢測等方法對該5株菌和本實(shí)驗(yàn)室保存的3株被AP631炭疽噬菌體裂解的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行毒力和基因測定。結(jié)果確定了8株可被AP631炭疽噬菌體不完全裂解的蠟樣芽胞桿菌。從疫點(diǎn)采集分離的5株菌青霉素敏感試驗(yàn)陰性，炭疽毒力基因PCR擴(kuò)增陰性，排除了炭疽芽胞桿菌；蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)染色試驗(yàn)為陰性，排除了蘇云金芽胞桿菌；根據(jù)溶血試驗(yàn)和生化反應(yīng)等一系列鑒別實(shí)驗(yàn)鑒定為蠟樣芽胞桿菌。8株菌的MLST基因檢測發(fā)現(xiàn)5株菌有新的等位基因位點(diǎn)或ST型。結(jié)論本研究首次證明我國使用的炭疽芽胞桿菌診斷AP631噬菌體可以不完全裂解部分蠟樣芽胞桿菌,存在非特異性裂解現(xiàn)象，提示在今后使用噬菌體鑒定炭疽桿菌時(shí)，對于外環(huán)境分離到的可疑芽胞桿菌，特別要注意關(guān)于噬菌體不完全裂解的問題，這將為炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)的正確制訂提供新的認(rèn)識并具有重要的指導(dǎo)意義。

AP631炭疽噬菌體；蠟樣芽胞桿菌；鑒定

Supported by the Funded Project of the State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control (No. 2011SKLID210)(Zhang Hui-juan,Liu Dong-li and He Li contributed equally to this work).

2015年我們在調(diào)查處理陜西省延安市甘泉縣炭疽疫情時(shí)，采集了該疫區(qū)外環(huán)境樣本65份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原分離鑒定，樣本包括死畜宰殺地、掩埋地、牲畜放牧的草地、圈舍里的土壤、糞便、飼料和捕捉到的牛虻等。結(jié)果從土壤樣本中分離到5株被炭疽芽胞桿菌(簡稱炭疽桿菌)AP631噬菌體不完全裂解的疑似菌株，經(jīng)青霉素敏感試驗(yàn)和炭疽桿菌毒力基因檢測均不符合炭疽桿菌的特征。為了確定是否存在可被AP631噬菌體裂解的其它芽胞桿菌屬，我們對該5株菌進(jìn)行了一系列鑒定，最終確定為蠟樣芽胞桿菌(簡稱蠟樣桿菌)，并對本實(shí)驗(yàn)室保存的333株蠟樣桿菌做AP631噬菌體裂解試驗(yàn)排查，發(fā)現(xiàn)了3株可被AP631噬菌體不完全裂解的蠟樣桿菌，首次證明我國使用的炭疽桿菌診斷用AP631噬菌體能夠不完全裂解部分蠟樣桿菌這一現(xiàn)象，存在非特異性裂解問題，同時(shí)對發(fā)現(xiàn)的8株蠟樣桿菌進(jìn)行了毒力測定實(shí)驗(yàn)和MLST基因檢測分型。 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1菌株來源5株菌株分離自疫點(diǎn)外環(huán)境土壤樣本，3株菌株來源于本實(shí)驗(yàn)室保存的已經(jīng)鑒定的333株蠟樣桿菌中。蠟樣桿菌對照株BC13061，蘇云金芽胞桿菌對照株BT3為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2AP631噬菌體噬菌體購自蘭州生物制品研究所，生產(chǎn)批號20150301。

1.3采集樣本和病原分離標(biāo)本采集，處理和病原分離參見《炭疽防治手冊》(1995)[1]。

1.4噬菌體裂解試驗(yàn)將被檢菌純培養(yǎng)物用接種環(huán)滴涂于LB瓊脂或TSSB 瓊脂平板上，滴加1滴相應(yīng)診斷炭疽AP631噬菌體，置37 ℃條件下培養(yǎng)8 h后觀察結(jié)果。

1.5炭疽桿菌鑒定實(shí)驗(yàn)

1.5.1青霉素抑菌實(shí)驗(yàn)將被檢菌純培養(yǎng)物用接種環(huán)滴涂于LB瓊脂平板上，在瓊脂平板表面貼放10U青霉素紙片，置37 ℃條件下過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

1.5.2炭疽桿菌特異基因PCR檢測PCR引物(表1)由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成，PCR 反應(yīng)擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃，1 min，退火55 ℃，1 min，延伸72 ℃，1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

表1炭疽桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增引物信息

Tab.1Primers for virulence genes of B.anthracis

基因Gene上游引物Forwardprimer(5'-3')下游引物Reverseprimer(5'-3')產(chǎn)物長度/bpPCRproductpagAATTTGCGGTAACACTTCACTAGACCGTGACAATGATGGAA923rpoBCCAACAGTAGAAATGCCAATTTCACCAGTTTCTGGATCT197capCCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCCGGATTGTATATGGAGTGGG1242

1.6蘇云金桿菌蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)取經(jīng)30 ℃培養(yǎng)24 h 并于室溫放置6 d的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s 后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色液(廣州威佳科技有限公司)持續(xù)1～2 min，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞(淺紅色)和染成深紅色的菱形、正方形或其它形狀的蛋白結(jié)晶體，以蘇云金芽胞桿菌為陽性對照。

1.7蠟樣桿菌鑒定實(shí)驗(yàn)

1.7.1染色鏡檢挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣桿菌為革蘭氏陽性芽胞桿菌，芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，菌體多呈短鏈或長鏈狀排列。

1.7.2溶血試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。蠟樣桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。

1.7.3生化反應(yīng)蠟樣桿菌生化鑒定套裝(購自北京陸橋技術(shù)有限公司)，用于蠟樣桿菌的生化鑒定(GB/T 4789.14-2014)試驗(yàn)，包括西蒙氏枸櫞酸鹽、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基、MR-VP、木糖-明膠、甘露醇、葡萄糖共6種生化鑒定管和配套試劑。

1.7.4小白鼠毒力測定試驗(yàn)供試小白鼠為體重18～20 g的BALB/c小白鼠(雌雄各半) ，常規(guī)飼養(yǎng)。將供試菌株制備成108cfu/mL的菌懸液0.2 mL，每株菌為一組，每組6只，經(jīng)皮下注射感染小白鼠，小白鼠皮下注射無菌1×PBS 0.2 mL/只作對照組，接種后觀察其發(fā)病和死亡情況。

1.7.5MLST基因檢測對可被AP631炭疽噬菌體不完全裂解的8株蠟樣桿菌的7個(gè)看家基因(glpF，gmk，ilvD，pta，pur，pycA，tpi)的多位點(diǎn)序列分型(MLST)進(jìn)行檢測，引物見網(wǎng)址http：//pubmlst.org/bcereus。引物合成和PCR產(chǎn)物序列測定均由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司完成。將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)基因比對，確定基因型。如有新的等位基因則向該網(wǎng)站提供原始測序數(shù)據(jù)，由網(wǎng)站指定菌株的新基因型。同時(shí)選取該網(wǎng)站已公布的不同ST基因型的蠟樣桿菌屬，其中包括炭疽桿菌和蘇云金桿菌，與本研究的菌株進(jìn)行比對，用Bionumerics 5.10軟件建立數(shù)據(jù)庫，分析各基因型，繪制基因型進(jìn)化樹。

2　結(jié)　果

2.1菌株特征及噬菌體裂解試驗(yàn)從65份環(huán)境樣本中分離到5株AP631噬菌體不完全裂解的菌株，均為革蘭氏染色陽性桿菌，菌落形態(tài)為典型卷發(fā)狀，分別編號為BC01,BC02,BC03,BC04和BC06。本實(shí)驗(yàn)室保存的333株蠟樣桿菌中有3株可被AP631噬菌體不完全裂解，編號為BC05,BC07,BC08，分別分離自云南、四川的土壤和河北的食品樣本。代表株BC06菌株涂片革蘭染色顯微鏡下觀察和噬菌體不完全裂解現(xiàn)象見圖1和圖2，蠟樣桿菌參考株BC13061不被AP631噬菌體裂解，作為陰性對照株。

圖1　BC06菌株涂片革蘭氏染色Fig.1　Gram staining for test strain named BC06

圖2　AP631炭疽噬菌體裂解BC06菌株觀察Fig.2　The test strain BC06 lysed by phage AP631

2.2炭疽桿菌鑒定實(shí)驗(yàn)

2.2.1青霉素抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株均對青霉素不敏感， 不符合炭疽桿菌的特征。

2.2.2PCR擴(kuò)增針對炭疽桿菌質(zhì)粒基因pagA，cap和染色體rpoB基因?qū)ι鲜?株菌擴(kuò)增均未擴(kuò)增到目的條帶(見圖3)。

1和20為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2-7為pagA基因擴(kuò)增，8-13為cap基因擴(kuò)增，14-19為rpoB基因擴(kuò)增，其中泳道2、8和14為炭疽桿菌陽性對照，其余為菌株BC01，BC02，BC03，BC04和BC06。圖3　pagA，cap和rpoB基因瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.3　Identification of gene of pagA，cap and rpoB by agarose gel electrophoresis

2.3蘇云金桿菌蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色5菌株均沒有發(fā)現(xiàn)染成深紅色的菱形、正方形或其它形狀的蛋白結(jié)晶體，排除蘇云金桿菌，如圖4所示，BT3為蘇云金桿菌陽性對照。

2.4蠟樣桿菌鑒定及檢測實(shí)驗(yàn)

2.4.1溶血試驗(yàn)溶血反應(yīng)顯示BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株均有約3 mm的溶血環(huán)，符合蠟樣桿菌的特征。

2.4.2生化特征試驗(yàn)顯示，5株菌均表現(xiàn)為：發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇，動力-硝酸鹽培養(yǎng)基、明膠試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(MR-VP)均為陽性，西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)為陰性，符合蠟樣桿菌的生化特征。

2.5動物試驗(yàn)BC01，BC02，BC03，BC04，BC06菌株感染小白鼠后在24～48 h內(nèi)全部死亡。

2.6MLST基因檢測8株蠟樣桿菌的看家基因結(jié)果顯示，有3株為已有ST基因型，其中BC06和BC08為基因型ST26，BC07為基因型ST785，其余5株菌均有1個(gè)或幾個(gè)新的等位基因，提交測序原始數(shù)據(jù)后被指定了新的等位基因號和ST型，BC01，BC02，BC03，BC04，BC05菌株分別為基因型ST1137，ST1138，ST1139，ST1140和ST1141(表2)。

圖4　5株菌蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色觀察Fig.4　Protein crystallization dying experiment of the test strains

表2MLST分析 8株蠟樣桿菌的看家基因情況

Tab.2Alleles and MLST profiles of the test strains

Strainno.AllelicgeneSTglpgmkilvDptapurpycAtpiBC01229*5248*240*127183*190*1137*BC02229*5248*240*16183*190*1138*BC038657818042128321139*BC04230*142*250*180 16149371140*BC05231*22118241*6666751141*BC0632315163426 BC07128879127785 BC0832315163426

注：*為新發(fā)現(xiàn)的等位基因和ST型。

Note：* New alleles and ST profiles.

基因型進(jìn)化樹如圖5所示，8株菌中BC01、BC02和BC04單獨(dú)成一簇，BC06和BC08基因型均為ST26，為含有嘔吐毒素的一類蠟樣桿菌，在我國其他地區(qū)也有報(bào)道，其余菌株則分散存在于不同的簇中。

圖5　研究菌株與其他蠟樣桿菌的基因進(jìn)化樹Fig.5　Phylogenetic tree of test strain and other Bacillus spp

3　討　論

AP631炭疽噬菌體是1963年董樹林和張守讓從水樣品中分離獲得的，自發(fā)現(xiàn)以來一直作為炭疽桿菌診斷用噬菌體應(yīng)用至今[1]。 AP631噬菌體為雙鏈DNA，其分子量約49 kb[2]。炭疽噬菌體的敏感性決定其宿主域的寬窄，如果待檢菌株是一株溶原性菌株，該菌株必本身攜帶有一個(gè)前噬菌體，否則不能被診斷噬菌體裂解；或者當(dāng)炭疽桿菌在含碳酸氫鈉培養(yǎng)基上，于CO2條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生豐厚的莢膜物質(zhì)掩蓋細(xì)菌的噬菌體受體，使噬菌體不能被吸附在菌體表面，因此不能起到裂解作用。以往AP631炭疽噬菌體的敏感性和特異性研究顯示它只裂解炭疽桿菌，對蠟樣桿菌和其它需氧芽胞桿菌均不能裂解[3]。目前在我們的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了被噬菌體AP631不完全裂解的蠟樣桿菌，證明噬菌體AP631有非特異性，其宿主域，不局限于炭疽桿菌，這在國內(nèi)尚屬首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。

AP631炭疽噬菌體的非特異性現(xiàn)象的原因，推測可能在炭疽桿菌的近緣菌之間有某些共同的抗原或共同的噬菌體受體。Davison S等人報(bào)道了γ噬菌體的受體(GamR)，可能是位于細(xì)菌細(xì)胞壁上的含有LPXTG結(jié)構(gòu)的表面蛋白，其編碼基因序列為BA3367(BAS3121)，并揭示蠟樣桿菌也具有同樣的敏感蛋白，與炭疽桿菌上的GamR具有89%的相似

性，通過對蘇云金桿菌基因測序分析，也具有類似的GamR編碼序列，可與γ噬菌體結(jié)合，不發(fā)生裂解[4]。根據(jù)16sRNA序列分析顯示蠟樣桿菌、炭疽桿菌、蘇云金桿菌和蕈狀桿菌同為蠟樣桿菌組[5]，本研究結(jié)果提示，是否蠟樣桿菌也具有AP631噬菌體受體結(jié)構(gòu)，其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

為了進(jìn)一步了解這些菌株的毒力及基因特點(diǎn)，我們還進(jìn)行了動物試驗(yàn)和管家基因檢測，結(jié)果顯示感染小白鼠均死亡，而基因分型顯示其中3株單獨(dú)成一簇，另外2株為相同基因型ST26，是含有嘔吐毒素的一類蠟樣桿菌，在我國其它地區(qū)也有報(bào)道，其余菌株則分散存在于不同的簇中，說明各菌株裂解域范圍廣泛。

通過本文報(bào)道提示我們在使用AP63噬菌體鑒定炭疽桿菌時(shí)，對于外環(huán)境分離到的可疑芽胞桿菌，特別對裂解不完全的現(xiàn)象判定要慎重。隨著炭疽分子水平上的研究不斷深入，關(guān)于炭疽的特異性引物不斷有所報(bào)道，傳統(tǒng)PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用越來越成熟，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測進(jìn)行輔助診斷，以得到更加準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，以防止漏檢或出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致結(jié)果的誤判誤報(bào)，延誤炭疽疫情的處置。這將為炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供新的認(rèn)識和對炭疽的防治具有重要的指導(dǎo)意義。

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Detection and identification ofBacilluscereussusceptible to phage AP631

ZHANG Hui-juan1, LIU Dong-li2, HE Li3, LI Wei1, ZHANG En-min1, WEI Jian-chun1, JI Jian-jun3,XU Su-li3, LIU Wei3, ZHANG Fa-xin3, MA Guo-zhu2, SHI Yi2, MA Lin2, LIANG Xu-dong1

(1.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;2.ShanxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;3.Yan’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Yan’an716000,China)

We identified the isolates which were susceptible to phage AP631, a specificBacillusanthracissusceptible phage. Five isolates ofBacilluscereusfrom soil in an anthrax endemic area and 3 preserved in our laboratory were identified by regular experiments including penicillin inhibition experiment, smear Gram staining, hemolysis testing, biochemical reaction, PCR analysis, mouse toxicity determination, protein crystallization dying experiment and MLST subtyping. All the tests supported the new bacterial isolates susceptible to AP631 phage wasB.cereusand excludedB.anthracisandB.thuringiensis. Three laboratory preserved isolates wereB.cereuswhich were identified previously. The fiveB.cereusisolates from soil were resistant to penicillin and PCR amplification targeted virulence genes showed negative in these strains. Protein crystallization dying experiment also displayed negative results, but the resultant biochemical reactions confirmed the 5 strains wereB.cereus. In addition, all 8B.cereusstrains were clustered as new allelic loci by MLST subtyping method. Our results demonstrate that bacterial phage AP631 is capable of lysingB.cereusin addition toB.anthracis, which suggests that there is some nonspecific lysis produced by AP631 and thereby we need pay more attention to the diagnosis ofB.cereusinfection to avoid misdiagnosis.

phage AP631;Bacilluscereus; identification

Liang Xu-dong, Email: liangxudong@icdc.cn

梁旭東，Email：liangxudong@icdc.cn

1.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206；2.陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安 710054；3.延安市疾病預(yù)防控制中心，延安 716000

R378.7

A

1002-2694(2016)06-0507-05

2016-02-03；

2016-04-28

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.001

傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No.2011SKLID210)(張慧娟，劉東立，賀莉有同等貢獻(xiàn))