長期單施化肥和有機無機配合條件下紅壤蔗區土壤生物學性狀及細菌多樣性差異

楊尚東, 李榮坦， 譚宏偉， 周柳強， 謝如林, 黃金生

(1 廣西大學農學院, 南寧 530004； 2 廣西農業科學院甘蔗研究所，廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室， 南寧 530007；3 廣西農業科學院農業資源與環境研究所， 南寧 530007)

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長期單施化肥和有機無機配合條件下紅壤蔗區土壤生物學性狀及細菌多樣性差異

楊尚東1，2, 李榮坦1， 譚宏偉2*， 周柳強3， 謝如林3, 黃金生3

(1 廣西大學農學院, 南寧 530004； 2 廣西農業科學院甘蔗研究所，廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室， 南寧 530007；3 廣西農業科學院農業資源與環境研究所， 南寧 530007)

【目的】分析紅壤區長期施肥的蔗區土壤生物學性狀和細菌多樣性，旨在提出提升紅壤蔗區土壤肥力與健康的施肥方案。【方法】試驗從1995年開始，于廣西來賓市蒙村鎮那洪村甘蔗長期試驗站進行。試驗設置不施肥(CK)、 長期單一施用化肥(NPK)和長期化肥配施有機肥(NPKM)3個處理。采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)以及稀釋平板法等傳統和現代分析技術，比較分析了3種長期不同施肥處理對蔗區土壤生物學指標、 細菌多樣性等指示土壤肥力與健康狀況指標的影響。【結果】施肥處理導致甘蔗產區土壤pH下降，NPK處理下降幅度大于NPKM處理。土壤中可培養微生物數量(細菌、 真菌和放線菌)均以NPKM處理為最高，NPK處理真菌數量顯著高于CK，放線菌數量卻顯著低于CK土壤，細菌數量兩者間無顯著差異。微生物量碳、 氮以及涉及碳、 氮、 磷循環的土壤酶活性均以NPKM處理土壤為最高，與NPK和CK土壤差異顯著。NPK處理土壤中β-葡糖苷酶活性以及微生物量碳高于CK土壤，但蛋白酶、 磷酸酶活性以及微生物量氮顯著低于CK土壤。NPKM處理土壤中細菌多樣性指數(H)、 豐富度(S)以及均勻度(EH)指數等同樣表征土壤肥力與質量的敏感指標均高于NPK和CK土壤。【結論】長期施肥可不同程度地導致紅壤蔗區土壤pH下降，長期單一施用化肥處理下降幅度高于化肥與有機肥配施處理。長期單一施用化肥加劇了土壤肥力下降與質量劣化，化肥配施有機肥是減緩紅壤甘蔗產區土壤pH下降、 提升土壤肥力和保持土壤健康的有效措施。

紅壤； 甘蔗； 長期施肥； 生物學性狀； 細菌多樣性

紅壤,包括紅壤、 赤紅壤和磚紅壤,是廣西主要的土壤類型，面積達1074萬公頃，占廣西土地總面積的65.55%[1]。廣西紅壤是廣西農業綜合開發和林業發展的重要基地，亦是農業生產強度高和實現廣西農業高產出的地區之一[2-3]。廣西甘蔗的栽培面積及蔗糖產量位居全國首位。2012/2013榨季，廣西甘蔗的種植面積達1080千公頃，甘蔗產量達7500.0萬噸，產糖791.5萬噸，占全國食糖總產的60.57%[4]。但過去相當長的一段時期里生產者以追求產量為主要目標，長期盲目地以化肥為主要肥源，缺乏維護蔗區土壤肥力意識。長期單一的化肥施用已導致蔗區土壤pH和肥力下降，甘蔗總產與產糖量從2008/2009榨季開始至2011/2012榨季連續3年下降[4]。究其原因，除了種植面積稍減之外，蔗區土壤肥力下降及土壤健康劣化亦是導致甘蔗產量下滑的另一個主要原因[5]。

1　材料與方法

1.1試驗區概況

1.2試驗設計

長期定位施肥試驗始于1995年。試驗設不施肥對照(CK)、 單施氮磷鉀化肥(NPK)、 氮磷鉀化肥加有機肥(NPKM)3個處理，試驗小區面積33.3 m2。供試化肥為尿素(N 46%)、 過磷酸鈣(P2O512.5%)和氯化鉀(K20 60%)，有機肥用農家堆漚糞肥(平均含N 7.1%、 P2O52.5%、 K2O 5.6%，其中有機氮占總氮的70%)。施肥處理不考慮有機肥中的氮、 磷、 鉀投入。化肥施用量為尿素600 kg/hm2、 過磷酸鈣90 kg/hm2、 氯化鉀225 kg/hm2， 有機肥4500 kg/hm2，所有肥料的10%作基肥，90%分2次追肥。

1.3樣品采集與制備

土壤樣品于甘蔗收獲后采集，2000年后每隔2年以相同取樣方法采集一次，本文采用2014年采集的樣品進行了對比分析。 每個處理小區按“之”字形用土鉆隨機采取0—30 cm的5點土壤樣品，混合均勻后平均分成2份。一份過2 mm篩后置于4℃保存，用于土壤生物學性狀及細菌群落結構的分析。另一份室內自然風干后過0.5 mm篩，用于土壤理化性狀的分析。

1.4分析方法

1.4.1 土壤微生物活性測定土壤微生物數量采用稀釋平板法[14]； 微生物生物量碳、 氮采用氯仿熏蒸提取法[15-16]； β-葡糖苷酶(β-Glucosidase)活性采用Hayano法[17]，以硝基苯-β-D-葡糖苷為基質； 蛋白酶(protease)活性采用Ladd法[18]，以白明膠為基質； 磷酸酶(phosphatase)活性采用Tabatabai和Bremner的方法[19]，以p-硝基苯磷酸鈉為基質。

1.4.2 土壤細菌群落結構土壤基因組總DNA的提取，參照Krsek和Welington的方法[20]并稍加修改進行。稱取5 g土壤，采用提取液和回收試劑盒(biospin gel extraction kit，Bioflux)進行基因組總DNA的提取和純化，粗提和純化結果采用1.0%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測； 純化后樣品于-20℃冰箱保存備用。

土壤細菌16S rDNA V3可變區的PCR擴增，采用對大多數細菌的16S rRNA基因V3區具有特異性的引物對F338GC和R518[21-23]，它們的序列(上游引物)分別為F338GC5′-(CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3′)； 下游引物為R518(5′-AT-TACCGCGGCTGCTGG-3′)，PCR產物用1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5數據處理

采用Quantity One分析軟件(Bio-Rad)對各土壤樣品的電泳條帶數目及密度進行定量分析。多樣性指數(Shannon-Wiener index，H)、 豐富度(S)和均勻度(EH)的計算參照羅海峰等[24]的方法進行。數據處理采用Excel 2003進行。

2　結果與分析

2.1長期不同施肥處理對蔗區土壤理化性狀的影響

基礎土樣和試驗18年后土壤理化性質見表1。與試驗前相比，人為干擾(施肥與種植)均不同程度地導致土壤pH下降。其中，以NPK處理土壤的下降幅度最大，不僅與試驗前相比呈顯著差異，而且與其他處理相比亦有顯著差異。NPKM處理與試驗前相比，土壤pH雖然也呈下降趨勢，但下降幅度顯著低于NPK處理，且在有機質含量、 全氮含量以及速效磷等部分理化性狀指標上亦顯著優于NPK處理。這一結果表明長期化肥配施有機肥有助于減緩土壤pH下降，提高土壤肥力。

表1　不同施肥處理試驗前后土壤理化性狀

2.2長期不同施肥處理對蔗區土壤可培養微生物數量的影響

由表2可知，NPKM處理土壤中可培養細菌數量不僅顯著高于CK，而且顯著高于NPK處理，但NPK處理和CK處理之間可培養細菌數量無顯著差異。另一方面，NPKM處理的可培養真菌數量亦顯著高于CK處理，但與NPK處理之間無顯著差異； 可培養放線菌數量亦是NPKM處理為最高，其次為CK處理，NPK處理最低，而且NPKM處理與CK處理和NPK處理之間均呈顯著差異。產生上述現象的原因是由于化肥配施有機肥增加了土壤有機質含量(表1)，進而顯著提高了土壤中可培養微生物的數量，而單一的NPK處理不利于提高土壤有機質含量。

表2　不同施肥處理18年后土壤可培養微生物數量 (cfu/g, dry soil)

注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—單施氮磷鉀化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有機肥Chemical and organic fertilizer combination; 數值后不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著 Values followed by different letters are significant among treatments at the 0.05 level.

2.3長期不同施肥處理對蔗區土壤酶活性的影響

β-葡糖苷酶活性可表征土壤碳素循環速度。三個處理土壤中β-葡糖苷酶活性大小為NPKM>NPK>CK，且NPKM處理顯著高于NPK和CK，表明化肥配施有機肥的土壤中碳素循環快，有助于提高和維持土壤肥力。

土壤磷酸酶活性高低直接影響著土壤有機磷的分解轉化及其生物有效性。土壤磷酸酶包括酸性磷酸酶、 中性磷酸酶和堿性磷酸酶[25]。本試驗供試土壤pH均在6以下，所以僅測定其中的酸性磷酸酶。蛋白酶參與土壤中蛋白質以及其他含氮有機化合物的轉化反應，其水解產物是植物吸收氮的來源之一[26]。從圖1可以看出，各處理土壤中酸性磷酸酶及蛋白酶活性大小均為NPKM>CK>NPK，NPKM處理顯著高于CK和NPK處理，NPK顯著低于CK。顯示化肥配施有機肥提高了土壤中氮、 磷的轉化和供應能力，而長期單施化肥卻降低了這一能力。

圖1　長期不同施肥處理對土壤酶活性的影響Fig.1　Soil enzyme activities affected by long-term fertilizations[注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—單施氮磷鉀化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有機肥Chemical and organic fertilizer combination; 柱上不同小、 大寫字母分別表示處理間在0.05和0.01水平上差異顯著 Different small and capital letters are significantly different among treatments at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.]

2.4長期不同施肥處理對蔗區土壤微生物生物量的影響

土壤微生物生物量是植物礦質養分的源和匯，是穩定態養分轉變為有效態養分的催化劑[27]。由表3可知，土壤中微生物量碳(MBC)高低為NPKM>NPK>CK，三個處理間差異顯著； 微生物量氮(MBN)高低為NPKM>CK>NPK，NPKM處理與CK和NPK處理差異顯著，CK與NPK處理間差異不顯著。這一結果與上述土壤酶活性類似，表明化肥配施有機肥對提升和維持紅壤蔗區土壤肥力的效果顯著優于單施化肥處理。

表3　長期不同施肥處理蔗區土壤微生物量碳、 氮含量(mg/kg)

注(Note): CK—空白土壤 No any fertilizer input； NPK—單施氮磷鉀化肥 Chemical fertilizer only； NPKM—化肥加有機肥 Chemical and organic fertilizer combination.數值后不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著 Values followed by different letters are significant among treatments at the 0.05 level.

2.5長期不同施肥處理對蔗區土壤細菌多樣性的影響

2.5.1 土壤細菌群落DGGE圖譜分析應用DGGE技術分離16S rRNA V3片段PCR產物，可分離到數目不等、 位置各異的電泳條帶(圖2)。根據DGGE能分離長度相同而序列不同DNA的原理，每一個條帶大致與群落中的1個優勢菌群或操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)相對應，條帶數越多，說明生物多樣性越豐富； 條帶染色后的熒光強度越亮，表示該種屬的數量越多[20]。土壤中細菌DGGE圖譜的條帶數量NPKM為31條，NPK為21條，CK為18條，NPKM處理的土壤細菌豐富度極顯著高于NPK和空白對照，NPK處理與空白差異不顯著。這一結果表明長期單一化肥處理對土壤細菌豐富度影響甚微，其原因可能與單一化肥處理沒有增加土壤有機質含量有關(表1)

圖2　長期不同施肥處理土壤細菌的DGGE圖譜和樹形聚類分析Fig.2　DGGE Profile and tree clustering analysis of soil bacteria collected from soils under different treatments

對土壤細菌多樣性進行相似性分析(圖2)，空白土壤和單一化肥處理之間土壤細菌的相似度較高，達82%； 化肥配施有機肥處理與化肥及空白土壤間土壤細菌的相似性系數低于60%，僅為57%。一般認為，相似性系數高于60%的兩個群體才具有較好的相似性[28]。試驗結果說明長期單一化肥處理與有機肥處理對土壤細菌群落結構影響差異顯著，而且長期單一化肥對土壤細菌群落結構的影響與空白處理無顯著差異，這一現象可能與單一的化肥處理無益于增加土壤中的有機質含量有關。

2.5.2 土壤細菌多樣性分析根據細菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中條帶的位置和亮度的數值化結果計算了細菌群落結構指標Shannon-Wiener指數，Shannon-Wiener指數值越大，表明細菌群落多樣性越高[29]。分析不同施肥處理土壤細菌Shannon-Wiener指數和均勻度指數(表4)。長期定位不同施肥處理土壤細菌多樣性指數的大小順序為NPKM(3.20)>NPK(2.45)>CK(2.31)，顯示有機無機肥配合處理有助于提高蔗區土壤細菌多樣性，長期單一化肥處理與空白相比，效果甚微，無助于提高土壤肥力，甚至在一定程度上導致土壤肥力下降及土壤健康的劣化。

均勻度是表示物種在環境中的分布狀況，各物種數目越接近，數值越高[30]。同樣由表4可知，3種施肥處理土壤中細菌均勻度指數以化肥配施有機肥為最高，而單一化肥處理和空白土壤之間土壤細菌均勻度指數并無大的差異。表明化肥配施有機肥處理對土壤細菌種群的分布以及菌群種類的影響效果顯著優于單一的化肥處理。

表4　長期不同施肥處理土壤細菌種群多樣性豐富度和均勻度指數

3　討論

土壤微生物數量受土壤溫度、 濕度、 通氣狀況、 耕作制度、 有機質含量及作物種類等因素的影響[31]。本研究中的土壤樣品采自相同蔗區，氣候條件一致，耕作管理一致，作物種類均為相同品種的甘蔗，因此土壤有機質含量應成為影響蔗區土壤微生物數量的主要影響因子。土壤中的有機物越多，土壤肥力越高，其中的微生物也就越多[32]。本文的分析結果顯示，化肥配施有機肥處理極顯著地提高了蔗區土壤中可培養微生物數量，其原因就是化肥配施有機肥提高了土壤有機質的含量，進而提高了蔗區土壤中可培養微生物的數量。

土壤酶主要來源于土壤微生物和根系分泌物。土壤中有機質的分解轉化，依賴于微生物所產生的酶具有的催化活性來推動，同時亦是指示土壤肥力變化的敏感指標[33]。化肥配施有機肥的土壤，無論涉及碳素循環的β-葡糖苷酶、 或涉及土壤磷循環的磷酸酶以及涉及氮循環的蛋白酶活性均較高，而單一施用化肥土壤除β-葡糖苷酶外，磷酸酶和蛋白酶活性甚至還低于空白土壤(圖1)，在一定程度上，表明單施化肥不利于土壤中氮、 磷循環的生物活動，導致土壤肥力降低，需要化肥與有機肥配合施用，才能達到既提高甘蔗的產量，又提高土壤肥力與維護土壤健康的作用。

4　結論

長期人為施肥均不同程度地導致紅壤蔗區土壤pH下降，單一施用化肥下降幅度最明顯。長期單施化肥會導致土壤微生物數量和涉及土壤碳、 氮、 磷循環的相關酶活性降低，表現為土壤微生物生物量碳、 氮量和細菌多樣性降低，土壤肥力下降和質量劣化。化肥配施有機肥可有效減緩單施化肥造成的土壤pH下降，保持土壤微生物多樣性和菌群數量，從而提升土壤肥力和保持土壤健康。

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Differences of soil biological characteristics and bacterial diversity of sugarcane fields in red soil region affected by long-term single chemical fertilization and chemical organic combined application

YANG Shang-dong1,2, LI Rong-tan1, TAN Hong-wei2*, ZHOU Liu-qiang3, XIE Ru-lin3, HUANG Jin-sheng3

(1CollegeofAgronomy,GuangxiUniversity,Nanning530004,China； 2GuangxiKeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement/GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China, 3AgriculturalResourceandEnvironmentResearchInstitute,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China)

【Objectives】 Study on the soil biological characteristics and bacterial diversity of soils affected by long-term fertilization will provide support for the sustainable development of sugarcane industry in Guangxi Province, 【Methods】 Long-term experiment started since 1995 in Laibin county, Guangxi Province. Three treatments include no fertilization (CK), chemical fertilizer only (NPK) and chemical fertilizer plus organic fertilizer (NPKM). Soil microorganisms were analyzed by using PCR-DGGE and dilution plate methods. 【Results】 The soil pH shows decreasing in the three treatments, particularly in the NPK treatment. The numbers of bacteria, fungi and actinomycetes were the highest in the NPKM treatment, which were significant higher than in the NPK and CK treatments. The number of cultivable actinomycetes in NPK treatment was significantly lower than in the CK, and there was no significant difference in numbers of bacteria and fungi between the NPK and CK. The activities of soil β-Glucosidase, phosphatase and protease were the highest in the NPKM treatment, and its biomass C and biomass N showed the highest as well. The activities of protease and phosphatase, and the biomass N in the NPK treatment were all lower than in CK. The bacterial diversity index, richness and evenness were all higher in the NPKM treatment. 【Conclusions】 The soil pH is easily declined by the input of fertilizers, particularly under the long-term single chemical fertilizer use. The long-term chemical fertilization may also result in low biodiversity and low activities of nutrient supply related enzymes in soil, leading to soil fertility decline and soil degradation. Conversely, the long-term combination use of chemical fertilizer and manure is effective in slowing the soil pH decline, improving soil fertility and ecological quality in sugarcane fields of red soil regions in Guangxi Province, China.

red soil; sugarcane; long-term fertilization; biological characteristic; bacterial diversity

2015-12-12接受日期: 2016-02-22

IPNI項目； 廣西農業科學院廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室開放課題(12-K-05-02)； 自治區重點項目(桂科基11199001)資助。

楊尚東(1970—)， 男， 廣西南寧人， 博士， 副教授, 主要從事植物營養與調控、 土壤生態學方向的研究。

Tel: 0771-3235612, E-mail: ysd706@gxu.edu.cn。*通信作者 Tel: 0771-3899558, E-mail: hongwei_tan@163.com

S157.4; S154.1; S154.38+1

A

1008-505X(2016)04-1024-07