嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定及分型

張麗麗（上海邦德職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒店管理分院，上海200444）

嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定及分型

張麗麗
（上海邦德職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒店管理分院，上海200444）

采集了市場(chǎng)中的220份嬰兒配方乳粉，利用生理生化和分子鑒定的方法對(duì)采集樣品中的克羅諾桿菌進(jìn)行了分離鑒定，檢出10株克羅諾桿菌，污染率為4.55%。利用16S rRNA和ompA基因?qū)肆_諾桿菌進(jìn)行分型分析，都將10株克羅諾桿菌分為了2個(gè)簇，但是不同分型方法各個(gè)簇中的菌株不同。結(jié)果表明16S rRNA和ompA基因可以用于克羅諾桿菌的分型，但是辨識(shí)度不高。

嬰兒配方乳粉；克羅諾桿菌；鑒定；分型

中國(guó)是嬰兒配方乳粉生產(chǎn)和銷售的大國(guó)，近年來(lái)消費(fèi)者對(duì)嬰兒配方乳粉的安全問(wèn)題也越來(lái)越關(guān)注。克羅諾桿菌是囊括了之前阪崎腸桿菌的一個(gè)新的屬，屬于腸桿科的食源性致病菌，也是嬰兒配方乳粉中的A類致病菌[1-2]。該致病菌能夠通過(guò)污染嬰兒配方乳粉感染新生兒，從而導(dǎo)致壞死性小腸結(jié)腸炎、膿血癥、腦膜炎等嚴(yán)重的疾病，甚至導(dǎo)致患兒的死亡[3-4]。目前在國(guó)內(nèi)的市售的嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌具有較高的污染率，這與克羅諾桿菌豐富的遺傳多樣性有著密切的聯(lián)系[5-6]。

本研究對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)中市售的嬰兒配方乳粉進(jìn)行了克羅諾桿菌的分離鑒定，并利用生理生化和16S rRNA的鑒定方法對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行了鑒定，最后采用16S rRNA和ompA基因?qū)Ψ蛛x到的克羅諾桿菌進(jìn)行了分子分型研究，從而有助于我們從分子層面了解污染我國(guó)嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分子特性，為揭示克羅諾桿菌的遺傳多樣性提供了理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1主要材料

1.1.1培養(yǎng)基

溶菌肉湯（Lysogeny Broth，LB）、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptose Soya Agar，TSA）、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）：上述培養(yǎng)基均購(gòu)買自青島海博生物有限公司。

1.1.2主要試劑

試驗(yàn)所需引物：由諾禾致源諾禾致源生物信息科技有限公司合成；細(xì)菌全基因組DNA試劑盒：北京天根生化科技有限公司；API20E試劑盒：上海百舜生物科技有限公司；2×PCR Master Mix：北京天根生化科技有限公司；D2000：百川開(kāi)泰生物技術(shù)（北京）有限公司；雙蒸水：上海榕柏生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：南京生興生物技術(shù)有限公司；1×TAE緩沖液：上海雙螺旋生物科技有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器

生物安全柜：山西天朗科技發(fā)展有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：濟(jì)南思卓醫(yī)療器械有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：廣州市中譽(yù)儀器有限公司；高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；普通PCR儀：賽飛（中國(guó)）有限公司；電泳儀：北京六一儀器廠。

2　方法

2.1采樣

在本市各個(gè)超市采購(gòu)嬰兒配方乳粉，共采購(gòu)220份嬰兒配方乳粉。

2.2克羅諾桿菌的分離鑒定

根據(jù)參考GB 4789.40-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行分離鑒定。

2.3克羅諾桿菌DNA的提取及16S rRNA分子分型

利用細(xì)菌全基因組DNA試劑盒提取克羅諾桿菌的DNA，利用16S rRNA的通用引物對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并送樣測(cè)序，在Genbank中對(duì)比測(cè)序后的基因序列得到菌株的鑒定結(jié)果，為了進(jìn)一步利用16S rRNA分子方法對(duì)分離菌株進(jìn)行分子分型，試驗(yàn)方法參照婁彬彬等的報(bào)道[7]。

2.4克羅諾桿菌ompA基因的分子分型

利用克羅諾桿菌ompA的特異性引物ompA F：5’-TAGACTTTACATCGCCAGGG-3’ 和 ompA R：5’-GAGCTTTCACGTTGTCACAG-3’，對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行特性性的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性2 min；變性94℃15 s，復(fù)性60℃15 s，延伸72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min[8]。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送樣測(cè)序，最后得到克羅諾桿菌ompA的基因序列。

2.5生物信息學(xué)分析

利用MEGA6.0軟件對(duì)克羅諾桿菌16S rRNA和ompA基因序列進(jìn)行最大似然算法系統(tǒng)發(fā)育分析。%%%%%%

3　結(jié)果與分析

3.1嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的分離鑒定

嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌分離鑒定的結(jié)果如表1所示。

利用通過(guò)GB 4789.40-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》的方法對(duì)嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示利用該方法，220份嬰兒配方乳粉中檢測(cè)12株疑似菌株，即在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基DFI中顯示出藍(lán)綠色菌落，且在TSA培養(yǎng)基中顯示為黃色可疑菌落。上述疑似克羅諾桿菌利用API20E試劑盒進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果顯示12株疑似克羅諾桿菌中11株為克羅諾桿菌即為陽(yáng)性，1株為陰性。最后利用分子生物學(xué)的方法對(duì)生化鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序，并將測(cè)序所得到的序列在Genbank中比對(duì)，結(jié)果顯示11株被生化鑒定為克羅諾桿菌的菌株10株為克羅諾桿菌，其中CE8雖然在生化檢驗(yàn)中為克羅諾桿菌，但是經(jīng)過(guò)分子水平的比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其為陰溝腸桿菌。可見(jiàn)220份嬰兒配方乳粉中分離到了10株克羅諾桿菌，該致病菌的污染率為4.55%。

表1　嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌鑒定結(jié)果Table 1　The result of identification ofthe Cronobacter spp.in powdered infantformula

3.2克羅諾桿菌16S rRNA分型

利用MEGA6.0軟件對(duì)分離得到的10株克羅諾桿菌的16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，10株克羅諾桿菌被分為了2個(gè)簇，其中 CE10、CE11、CE9、CE1和 CE2為一簇，CE7、CE12、CE3、CE5和CE6為一簇。同時(shí)標(biāo)尺為0.0005說(shuō)明就整體而言，10株克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是很近的，因此雖然16S rRNA可以用于簡(jiǎn)單的分型，但是辨識(shí)度并不高。

3.3克羅諾桿菌ompA基因的分型

圖1　克羅諾桿菌16S rRNA序列的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Maximum-likelihood tree of 16S rRNA gene for Cronobacter strains

利用MEGA6.0軟件對(duì)10株克羅諾桿菌ompA基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，并得到了清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，如圖2所示。

圖2　克羅諾桿菌ompA基因序列的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Maximum-likelihood tree of ompA gene for Cronobacter strains

由圖2可知，10株克羅諾桿菌的ompA基因被分為了兩個(gè)簇，一簇為CE11、CE2、CE3、CE10、CE9、CE1、CE6、CE5和CE7，一簇為CE12，且CE12明顯遠(yuǎn)離了其他的9株克羅諾桿菌，這說(shuō)明CE12的ompA基因明顯區(qū)別于其他9株菌。ompA基因與克羅諾桿菌的侵染能力和致病能力有關(guān)，因此CE12可能具有特殊的侵染能力。此外我們發(fā)現(xiàn)利用ompA基因?qū)肆_諾桿菌分型的辨識(shí)度較低。

4　結(jié)論與討論

在本研究中市售的嬰兒配方乳粉克羅諾桿菌的污染率為4.55%，這表明克羅諾桿菌仍是嬰兒配方乳粉中重要的致病菌。在2014年的調(diào)查中克羅諾桿菌的污染率為4.3%[11]，這與我們的研究結(jié)果相似，此外一些研究也表明在嬰兒配方乳粉的生產(chǎn)過(guò)程中包裝環(huán)節(jié)是最易被克羅諾桿菌污染的環(huán)節(jié)之一[1，11]。在本研究中，我們利用了生理生化和分子鑒定的方法對(duì)嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌進(jìn)行分離鑒定，利用GB 4789.40-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》的方法，12株克羅諾桿菌的疑似菌株被分離鑒定，經(jīng)過(guò)API20E的20個(gè)生理生化指標(biāo)的鑒定發(fā)現(xiàn)12個(gè)疑似菌株中11個(gè)為克羅諾桿菌，而16S rRNA分子鑒定的結(jié)果則表明12株克羅諾桿菌疑似菌株中10個(gè)為克羅諾桿菌，這表明API20E的鑒定方法優(yōu)于顯色性培養(yǎng)基的鑒定方法，但是16S rRNA的分子鑒定方法可以從分子層面對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，比API20E的生理生化鑒定更具優(yōu)越性。

16S rRNA是最常見(jiàn)的用于克羅諾桿菌分型的基因之一[1]。婁彬彬等利用16S rRNA對(duì)分離自嬰兒配方乳粉中的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行了分子分型，并發(fā)現(xiàn)16S rRNA分子分型的辨識(shí)度有限，但是仍能對(duì)阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行分子分型[7]。ompA基因是編碼克羅諾桿菌外膜蛋白A的重要基因，與克羅諾桿菌的致病能力有關(guān)[8]。我們的研究表明此基因也可以用于克羅諾桿菌的分子分型，且具有一定的辨識(shí)度。此外，在目前克羅諾桿菌分子分型的研究中，ITS序列分型、脈沖場(chǎng)電泳分型、多位點(diǎn)序列分型等方法也已經(jīng)用于克羅諾桿菌的分型中[6，9-10]。

[1]Peng F,Chaoxin M,Binbin L,etal.Genotyping and source tracking of Cronobacter sakazakii and C.malonaticus isolates from powdered infant formula and an infantformula production factory in China[J]. Applied&EnvironmentalMicrobiology,2015,81(16):5430-5439

[2]董曉暉,李程思,吳清平,等.食品污染克羅諾桿菌(阪崎腸桿菌)的分離及鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(5):429-436

[3]王翔,祝長(zhǎng)青,徐幸蓮,等.阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)分子檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2011(13):350-354

[4]董曉暉,吳清平,莫樹(shù)平,等.克羅諾桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,32(1):130-136

[5]Sumyya H,Susan J,Forsythe S J.Cronobacter sakazakii ST4 Strains and Neonatal Meningitis,United States[J].Emerging Infectious Diseases,2013,19(1):175-177

[6]Joseph S,SonbolH,HaririS etal.Diversity ofthe Cronobacter genus as revealed by multilocus sequence typing[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(9):3031-3039

[7]婁彬彬,滿朝新,費(fèi)鵬,等.阪崎克羅諾桿菌的16S rDNA鑒定分型[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2015,21(7):39-42

[8]Ks M N M V.Cloning and sequencing of the ompA gene of Enterobacter sakazakii and development of an ompA-targeted PCR for rapid detection of Enterobacter sakazakii in infant formula[J].Applied&Environmental Microbiology,2006,72(4):2539-2546

[9]牛婕婷,滿朝新,費(fèi)鵬,等.阪崎克羅諾桿菌的ITS序列分析[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2015,21(3):27-30

[10]柴云雷,滿朝新,盧雁,等.PFGE與16S rDNA對(duì)阪崎克羅諾桿菌分型的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2014,42(10):11-14

Isolation，Identification and Type of the Cronobacter spp.in Powdered Infant Formula

ZHANG Li-li
（Hospitality Elite School，Shanghai Bangde Vocational College，Shanghai200444，China）

220 powdered infant formula samples were collected from markets.10 Cronobacter strains were isolated and identified using the physiological，biochemical and molecular identification methods，with a contamination rate of 4.55%.10 Cronobacter strains were divided into two clusters respectively by the 16S rRNA and ompA genes analysis，however，the composition of strains were different in each cluster by different methods. The above results showed that the 16S rRNA and ompA genes could be used for the Cronobacter type with the nothigh distinguishability.

powdered infantformula；Cronobacter spp.；identification；type

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.039

張麗麗（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

2016-03-02