α-淀粉酶產生菌的篩選鑒定及其發酵條件的優化

李鑫玲，孫曉菲，李欣

α-淀粉酶產生菌的篩選鑒定及其發酵條件的優化

李鑫玲，孫曉菲，李欣

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003）

從土壤樣本中分離出一株產α-淀粉酶的菌株，經形態學初步鑒定為熱紅短芽孢桿菌。對該菌株產酶條件進行了優化，確定其最佳碳源為麩皮，最佳氮源為明膠，最佳pH值為10，最佳初始裝液量為60 mL。

α-淀粉酶；熱紅短芽孢桿菌；篩選；優化

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中。根據水解淀粉生成糖類產物的異頭碳原子構型的不同可將淀粉酶分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶是商品化生產最早、應用最早、應用范圍最廣和用量最大的工業酶類之一。目前，α-淀粉酶已廣泛應用于燃料酒精、淀粉糖漿、傳統釀造、食品加工、紡織退漿等行業[1-2]。

本文對α-淀粉酶產生菌進行分離，并對其發酵條件進行優化，旨在為該菌的應用研究提供參考。發酵培養基。

1.2方法

1.2.1菌種初篩

稱取5 g土壤樣品溶于45 mL無菌水（含玻璃珠）中震蕩10 min，上清液為菌原液。無菌水梯度稀釋至10-7濃度。取10-5、10-6和10-7稀釋度涂布于平板篩選培養基中，30℃培養48 h。選擇有單菌落的平板，噴灑稀碘液觀察有無透明圈，記錄菌落特征，透明圈大小等。挑取透明圈明顯且透明圈直徑與菌落直徑之比較大的單菌落斜面保藏，作為初篩菌株。

1.2.2菌種復篩及發酵方法

初篩菌株接種于50 mL種子培養基中30℃、150 r/min搖床培養24 h。種子液按10%的接種量接種于50 mL產酶液體培養基中，30℃、150 r/min搖床培養48 h后取發酵液4.5 mL于離心管中10 000 r/min離心5 min，取上清液測酶活，每個樣品重復3次，最后結果求平均值。取酶活最高的一個作為復篩菌株。

1.2.3淀粉酶活的測定

YoungJ.Yo改良法[4]：取5 mL 0.5%的可溶性淀粉

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

土樣來源于河南洛陽，河南科技大學學校周圍淀粉含量豐富的果園中，共采集45份土樣，供分離用。

1.1.2培養基[3]

斜面培養基、平板分離培養基、篩選培養基、固態溶液，在40℃水浴中預熱10 min，然后加適當稀釋的酶液0.5 mL，反應5 min后，用5 mL 0.1 mol/L硫酸終止反應。取0.5 mL反應液與5 mL工作碘液顯色，在620 nm處測光密度。以0.5 mL水代替0.5 mL反應液為空白，以不加酶液（加緩沖液）的管為對照。調整D使（R0-R）/R0在0.2～0.7之間。淀粉酶活計算公式如下：

酶活力/（U/mL）=（R0-R）/R0×D×50

式中：R0、R分別表示對照和反應液的吸光光度值；D為酶的稀釋倍數。

酶活力單位定義：在40℃，pH6.0，1 g干曲5 min內水解1 mg淀粉（0.5%淀粉）的酶量為一個活力單位。

2　結果與分析

2.1菌種篩選

通過用含淀粉的平板篩選培養基進行培養，得到4株產酶較穩定的菌株，經產酶液體培養，發現5號菌株產酶能力最強。因此，選定5號菌株為本次篩選的結果，進行后續試驗。

2.2菌株的鑒定結果

5號菌株為桿狀兼性厭氧、革蘭氏陽性菌，芽孢為圓形或橢圓，菌落呈乳白色，干燥，圓形，扁平，表面皺褶，邊緣不整齊，不透明。接觸酶試驗陽性，甲基紅試驗陽性，明膠液化試驗陽性，檸檬酸鹽試驗陰性，V.P.試驗陰性。根據《常見細菌系統鑒定手冊》與《伯杰細菌鑒定手冊》初步判斷此菌為熱紅短芽孢桿菌[5-6]。

2.3發酵條件優化

2.3.1不同碳源對產酶的影響

不同碳源對產酶的影響見圖1。

圖1　不同碳源對產酶的影響Fig.1　Effects of different carbon sources on enzyme production

碳源是微生物生命活動的重要能源物質，菌種對碳源的利用程度直接影響到酶的產量。結果顯示，碳源的產酶順序為麩皮，葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，糊精。以麩皮為碳源時酶活最高，糊精最低。故選麩皮作為碳源。

2.3.2不同氮源對產酶的影響

不同氮源對產酶的影響見圖2。

圖2　不同氮源對產酶的影響Fig.2　Effects ofdifferentnitrogen sources on enzyme production

由圖2可知，添加不同氮源的產酶順序為明膠、黃豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）H2PO4、NH4Cl、NaNO3。以明膠作為氮源時酶活最高，黃豆粉次之，無機鹽較低。故選明膠作為最佳氮源。工業生產時考慮成本需求可選價格低廉的黃豆粉作為氮源。

2.3.3初始pH值對產酶的影響

在pH 6～pH12的范圍內調節培養基的初始pH，結果見圖3。

圖3　初始pH值對產酶的影響Fig.3　Effects ofdifferentinitialpH on enzyme production

由圖可知菌株在初始pH 8～pH11范圍內酶活較高，其中pH值為10時酶活最高。

2.3.4裝液量對產酶的影響

不同裝液量影響搖床培養時的通氣量，其對產酶的影響見圖4。

圖4　裝液量對產酶的影響Fig.4　Effects of different amounts on enzyme production

由圖4可知，酶活隨著裝液量的增加而增大，60 mL時達到最大，隨后酶活有所下降。其原因是隨著裝液量的減少菌體濃度降低，故酶活低；而裝液量過大時，通氣較差，酶活也有所降低。故選60 mL為最佳裝液量。

2.3.5底物（淀粉及葡萄糖）含量對產酶的影響底物含量對產酶的影響結果見圖5、圖6。

圖5　淀粉含量對產酶的影響Fig.5　Effects ofstarch contenton enzyme production

圖6　葡萄糖含量對產酶的影響Fig.6　Effects ofglucose contenton enzyme production

由圖5可知，不含淀粉時酶活最高，隨淀粉含量的增加酶活逐漸降低。可能是因為發酵液中菌體分解淀粉所致。

由圖6可知，葡萄糖添加量為1%時酶活最大，之后隨著葡萄糖添加量的增加酶活逐漸降低。其原因可能是葡萄糖是較容易被利用的碳源，當添加量適當時促進菌體生長，即促進產酶；但添加量過高時存在葡萄糖抑制作用，即抑制產酶。

2.3.6離子（Ca2+與Na+）含量對產酶的影響

離子（Ca2+與Na+）含量對產酶的影響見圖7。

由圖7可知，Ca2+促進產酶，其中0.2%～0.4%的Ca2+促進效果最好；Na+則抑制產酶，酶活力隨著Na+含量的增加而降低。其原因可能是Ca2+使該酶保持適當構象，起到穩定作用；而Na+增加發酵液中鹽離子濃度[7]。

圖7　離子（Ca2+與Na+）含量對產酶的影響Fig.7　Effects ofion（Ca2+and Na+）content on enzyme production

3　結論

土壤中蘊含豐富的微生物資源，α-淀粉酶在微生物中分布廣泛。從微生物中篩選出具有新特性和高活力的α-淀粉酶是一項非常有意義的工作。本研究從淀粉含量豐富的果園土壤中篩選出一株α-淀粉酶產生菌的菌株，經形態鑒定和生理生化鑒定，初步確定為熱紅短芽孢桿菌。對該菌株產酶條件進行了優化，確定其最佳碳源為麩皮；最佳氮源為明膠；最佳pH值為10；最佳初始裝液量為60 mL；底物淀粉抑制產酶，1%的葡萄糖促進產酶；0.2%～0.4%的Ca2+促進產酶，Na+抑制產酶。

[1]洪新,唐克.耐酸性α-淀粉酶產生菌發酵條件的優化[J].中國畜牧獸醫,2009,36(1):145-147

[2]蔣若天.一株產耐高溫α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌的篩選與分離及產酶條件與酶學性質的研究[D].成都:四川大學,2007

[3]李江華,房峻.真菌α-淀粉酶產生菌的篩選及其固態發酵條件的初步研究[J].食品科學,2007(11):373-378

[4] 張強,劉成君,蔣芳,等.耐高溫α-淀粉酶產生菌的分離鑒定及發酵條件與酶性質研究[J].食品與發酵工業,2005(2):34-37

[5] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社, 2001:43-377

[6]R E布坎南,N E吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學出版社,1984:65-128

[7]劉雪崢,吳京平,何立千.淺析金屬離子對α-淀粉酶活力的影響[J].中國釀造,2000(2):12-15

Identification of theα-Amylase Producing Strain and Optimization of the Fermentation Conditions

LIXin-ling，SUN Xiao-fei，LIXin
（Food and Bioengineering Department，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

Anα-amylase-producing strain was screened and isolated from soilsamples.The strain was preliminarily identified as B.thermonber by morphologic taxonomy.The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources，carbon sources and other influence factors.The optimum carbon and nitrogen source was bran and gelatin.The optimum pH was 10 and the bestamountwas 60 mL.

α-amylase；B.thermonber；screening；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.038

李鑫玲（1982—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：畜產品加工及食品質量與安全。

2015-09-01