乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

王菲菲（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014045）

乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

王菲菲
（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014045）

對(duì)乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究。經(jīng)試驗(yàn)確定乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112最適培養(yǎng)基為：葡萄糖為5 g/L，乳糖為5 g/L，酪蛋白胨3.3 g/L，大豆蛋白胨3.3 g/L，魚蛋白胨3.3 g/L，β-甘油磷酸二鈉28.5 g/L，Tween-80 0.5 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，乙酸鈉1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，檸檬酸鈉0.62 g/L，抗壞血酸鈉1.5 g/L。在此增殖培養(yǎng)基中經(jīng)30℃，14 h培養(yǎng)活菌數(shù)提高了4.3倍。

乳酸乳球菌乳脂亞種；增殖培養(yǎng)基；優(yōu)化

乳酸乳球菌乳脂亞種是一類具有潛在益生特性的乳酸菌，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。作為發(fā)酵劑的重要菌種來源，乳酸乳球菌乳脂亞種在益生菌發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用[1]，也可用于干酪的生產(chǎn)，其產(chǎn)品組織狀態(tài)和風(fēng)味良好[2]。本文就乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以得到最適的培養(yǎng)基組成，為該菌株高密度培養(yǎng)以及商品發(fā)酵劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112：分離自錫林鍋勒盟牧區(qū)，由包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院乳品工程學(xué)院菌種庫保藏。

1.2菌株的保存與活化

乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112菌株于甘油管中-80℃保存，使用前，接種于M17培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)8 h～10 h，活化兩代后備用。

1.3主要培養(yǎng)基

M17液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉2.5 g，牛肉膏5 g，β-甘油磷酸二鈉28.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，抗壞血酸鈉1.5 g，乳糖10 g，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L HCl調(diào)pH為7.2，121℃15 min滅菌。

M17瓊脂培養(yǎng)基：M17液體培養(yǎng)基中加人1.5%瓊脂粉，121℃15 min滅菌[3]。

1.4主要儀器

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；BPX-82電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCN-1360B超凈工作臺(tái)：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；AL204電子分析天平、FE20K PH計(jì)：梅特勒－托利多食品（上海）有限公司；T6紫外/可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Kjeltec 2300全白動(dòng)凱氏定氮儀：丹麥Foss公司；FT120乳成分分析儀：瑞士FOSS公司；Nova Satety乳脂肪離心機(jī)：德國Gerber公司。

1.5方法

在M17基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，采用單因素試驗(yàn)對(duì)其增殖培養(yǎng)基成分中的氮源、碳源、生長因子及緩沖鹽進(jìn)行選擇，通過正交試驗(yàn)對(duì)各成分之間的配比進(jìn)行優(yōu)化。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在M17基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，用不同的碳源分別取代M17中的碳源，篩選出適宜菌株生長的碳源，采用不同比例的適宜碳源，接種發(fā)酵，根據(jù)生長末期菌體生長情況判斷菌體適合生長的碳源及其碳源比例。采用復(fù)合配比試驗(yàn)確定優(yōu)化的不同碳源的復(fù)配效果。不同碳源對(duì)菌株BTQY-112生長情況的影響見圖1，不同濃度葡萄糖和乳糖對(duì)BTQY-112菌株生長情況的影響見圖2。

圖1　不同碳源對(duì)菌株BTQY-112生長情況的影響Fig.1　The effectofcaborn on the growth of BTQY-112

圖2　不同濃度葡萄糖和乳糖對(duì)BTQY-112菌株生長情況的影響Table 2　The effectofratio of glucose and lactose on the growth of BTQY-112

從圖1、圖2可知，不同種類碳源以及不同碳源濃度對(duì)菌體濃度的影響比較明顯，為降低培養(yǎng)基成本，選擇乳糖和葡萄糖作為優(yōu)化后碳源，且菌株BTQY-112利用葡萄糖和乳糖的最佳濃度為0.5%。

2.2培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

用不同的氮源代替M17中的氮源，篩選出適宜菌株生長的氮源，并采用不同比例的適宜氮源，以優(yōu)化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，接種發(fā)酵，根據(jù)生長末期菌體生長情況判斷菌體適合生長的氮源及其氮源比例。采用復(fù)合配比試驗(yàn)確定優(yōu)化氮源的復(fù)配效果。不同氮源對(duì)菌株BTQY-112生長的影響見圖3。

圖3　不同氮源對(duì)菌株BTQY-112生長的影響Fig.3　The effect of nitrogen on lactic acid bacteria growth of BTQY-112

如圖3可見，酪蛋白胨、大豆蛋白胨和魚蛋白胨對(duì)菌株增殖效果較好，固按總氮的添加量1%對(duì)酪蛋白胨、大豆蛋白胨和魚蛋白胨進(jìn)行復(fù)配，見表1。不同氮源復(fù)配對(duì)菌株BTQY-112生長的影響見圖4。

表1　氮源復(fù)配試驗(yàn)方案Table 1　Test Scheme ofcomplex formulation of carbon source

圖4　不同氮源復(fù)配對(duì)菌株BTQY-112生長的影響Fig.4　The effectof ratio ofnitrogen on the lactic acid bacteria growth of BTQY-112

從圖4可見，7#復(fù)配氮源條件下菌株的生長情況良好，所以確定酪蛋白胨∶大豆蛋白胨∶魚蛋白胨復(fù)配氮源的比例為0.33%∶0.33%∶0.33%。

2.3培養(yǎng)基生長因子的優(yōu)化

在上述優(yōu)化碳源和氮源的基礎(chǔ)上，以Tween80、抗壞血酸鈉、CaCl2、半胱氨酸鹽酸鹽（CysHCl）和啤酒5種為生長因子，按不同的濃度添加到培養(yǎng)基中，以不添加生長因子的優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，接種試驗(yàn)菌株發(fā)酵，根據(jù)最終菌體生長情況，確定微量元素及生長因子的種類和濃度[4]。不同生長因子對(duì)菌株BTQY-112生長的影響見圖5。

圖5　不同生長因子對(duì)菌株BTQY-112生長的影響Fig.5　The effect ofratio ofgrowth factors on the growth of BTQY-112

圖5所示不同種類、不同濃度的生長因子抗壞血酸鈉、CaCl2、半胱氨酸鹽酸鹽對(duì)菌株生長增殖情況改善不大，這說明已確定培養(yǎng)基中增殖因子種類和含量已滿足菌株生長所需，不需要優(yōu)化上述生長因子。啤酒生長因子反而降低了菌株生物量，阻礙菌體生長。該菌株對(duì)半胱氨酸鹽酸鹽更為敏感，隨著濃度的增加，生物量明顯降低。只有Tween-80具有一定的促生長效果，且最佳添加量為0.05%。

2.4培養(yǎng)基緩沖體系的優(yōu)化

以上述優(yōu)化條件后的M17培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同的緩沖鹽體系，以不添加緩沖鹽的優(yōu)化培養(yǎng)基為對(duì)照，接種試驗(yàn)菌株發(fā)酵，根據(jù)最終菌體生長情況，確定最優(yōu)的緩沖體系。優(yōu)選的緩沖鹽之間的優(yōu)化效果采用正交試驗(yàn)確定。不同緩沖鹽體系培養(yǎng)基中BTQY-112的菌體密度見表2。

表2　不同緩沖鹽體系培養(yǎng)基中BTQY-112的菌體密度Table 2　Celldensity of BTQY-112 growing in medium with differentbuffers

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，選定K2HPO4、檸檬酸鈉和乙酸鈉的復(fù)合緩沖鹽體系進(jìn)行下一步試驗(yàn)。設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)緩沖鹽體系組成比例進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化。試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)及其結(jié)果見表3。

表3　緩沖鹽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3　The results of orthogonaltests of buffer salt

從表3正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可以看出，三因素對(duì)菌株生長的影響值大小為C>A>B，即乙酸鈉> K2HPO4>檸檬酸鈉，最優(yōu)緩沖鹽配比為C1A2B1，即乙酸鈉∶K2HPO4∶檸檬酸鈉為0.15%∶0.08%∶0.06%，經(jīng)試驗(yàn)在此配比下得到的OD值為2.413。

2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基各組分的優(yōu)化

經(jīng)過上述單因素優(yōu)化試驗(yàn)后，進(jìn)行正交分析試驗(yàn)，以確定各影響因素最佳的比例濃度。增殖因子Tween-80用量非常少，用量為0.05%，為了方便試驗(yàn)不將它作為試驗(yàn)因素考慮，只作為固定因子以0.05%用量添加到M17培養(yǎng)基。其中復(fù)合碳源為葡萄糖∶乳糖（0.5%∶0.5%），復(fù)合氮源為酪蛋白胨∶大豆蛋白胨∶魚蛋白胨（0.33%∶0.33%∶0.33%），復(fù)合緩沖鹽體系為乙酸鈉∶K2HPO4∶檸檬酸鈉（0.15%∶0.08%∶0.06%）。M17各組分優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表4所示。

表4　優(yōu)化M17培養(yǎng)基各物質(zhì)正交因素水平表Table 4　Factors and levels of orthogonalexperimentin M17

按照表4正交試驗(yàn)因素水平表對(duì)M17培養(yǎng)基各影響因子進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，接種后30℃靜置培養(yǎng)8 h后取出試驗(yàn)樣品，檢測其OD值。正交結(jié)果及分析結(jié)果如表5所示。

表5　優(yōu)化增菌培養(yǎng)基M17的正交分析試驗(yàn)結(jié)果表Table 5　Results oforthogonalexperimentin M17

乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112效應(yīng)值大小為A>B>C，即碳源>氮源>緩沖鹽，優(yōu)化培養(yǎng)基配比為A2B2C3，復(fù)合碳源為1%，即葡萄糖為0.5%，乳糖為0.5%。復(fù)合氮源為1%，即酪蛋白胨0.33%，大豆蛋白胨0.33%，魚蛋白胨0.33%。緩沖鹽總添加量為0.3%，即乙酸鈉1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，檸檬酸鈉0.62 g/L。

3　結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)確定乳酸乳球菌乳脂亞種BTQY-112最適培養(yǎng)基為：葡萄糖為5 g/L，乳糖為5 g/L，酪蛋白胨3.3 g/L，大豆蛋白胨3.3 g/L，魚蛋白胨3.3 g/L，Tween-80 0.5 g/L，β-甘油磷酸二鈉28.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，乙酸鈉1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，檸檬酸鈉0.62 g/L，抗壞血酸鈉1.5 g。在此增殖培養(yǎng)基中經(jīng)30℃，14 h培養(yǎng)活菌數(shù)提高了4.3倍，為該菌株的高密度培養(yǎng)確定適宜增殖培養(yǎng)基組成，進(jìn)而為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。

[1]王蕊.開菲爾(Kefir)酸牛乳酒中乳酸菌分離及發(fā)酵性能測定[J].中國釀造,2009(7):99-102

[2]任娟.發(fā)酵劑在羊奶干酪中應(yīng)用技術(shù)的研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2010

[3]曹文海,任國譜.嗜熱鏈球菌的檢驗(yàn)培養(yǎng)基(M17)的改良[J].中國乳業(yè),2006(1):43－45

[4] 張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1997:33

Study on the Optimization of Enrichment Medium of Lactococcus lactis subsp.BTQY-112

WANG Fei-fei
（Baotou Light Industry Vocational TechnicalCollege，Baotou 014045，Inner Mongolia，China）

The optimization ofproliferation culture medium for Lactococcus lactis subsp.BTQY-112 was studied.The bestmedium was gotwith the composition of5 g/L glucose，lactose 5 g/L，casein peptone 3.3 g/L，soybean peptone 3.3 g/L，fish peptone 3.3 g/L，β-glycerol phosphate disodium salt 28.5 g/L，Tween-80 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，sodium acetate 1.55 g/L，K2HPO40.83 g/L，sodium citrate 0.62 g/L，sodium ascorbate 1.5g/L.After cultivated in enrichmentmedium for 14 h at30℃，number oflive bacteria increased 4.3 times.

Lactococcus lactis subsp.；proliferation culture medium；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.037

王菲菲（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

2015-06-05