蜜環菌生長培養基的優化及雜菌的分離鑒定

李再新，唐文才（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

蜜環菌生長培養基的優化及雜菌的分離鑒定

李再新，唐文才
（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

為提高蜜環菌產量，采用正交試驗法對蜜環菌生長培養基中葡萄糖、酵母粉、維生素B13個組分的添加量進行優化，利用平板法分離出影響蜜環菌生長的主要雜菌并采用分子生物學的方法對污染菌株進行鑒定。試驗結果表明：葡萄糖45 g/L、酵母粉9 g/L、維生素B10.05 g/L為最佳配方。分離出兩株霉菌，經過鑒定，分別為橘青霉Penicillium citrinum t1、塔賓黑曲霉Aspergillus tubingensis t2。

蜜環菌；正交試驗；rDNA-ITS菌種鑒定；篩選

蜜環菌屬于擔子菌綱、傘菌目、真菌的一屬。名貴藥材天麻，豬苓的生長離不開蜜環菌，蜜環菌是天麻無性繁殖生長階段的物資基礎[1]。近年人們對天麻保健功能的不斷認識，天麻價格不斷上漲且其需求旺盛，種植面積快速擴張，據統計2012年天麻全國的總產量大概在2 000 t左右[2]。優質天麻的生長主要在海拔1 500 m～3 000 m的偏遠高寒山區，山區種植資源狹窄，種植技術落后，長期處于貧困狀態，因此天麻的栽培是山區人們致富的重要途徑。天麻對蜜環菌具有寄生關系，蜜環菌的健壯生長是高品質天麻栽培的基本條件，但在天麻栽培過程中蜜環菌主要以闊葉樹木的木塊為原料，積累營養，為天麻的生長提供養料[3]，同時蜜環菌生長固體瓊脂糖平板培養基也需要用木塊的浸提液配制，這種培養基成分也非常適合木霉和青霉菌等雜菌的生長而且比蜜環菌生長更快，因此在蜜環菌的培養中木霉和青霉污染對蜜環菌的純培養形成了巨大的威脅，也降低了在栽培過程中蜜環菌對有限木材的利用率，嚴重影響了天麻的產量和品質[4]。本研究旨在對蜜環菌生長所需要的條件進行優化，并對污染蜜環菌純種培養的菌進行分離鑒定，對以后蜜環菌培養基中雜菌專一抑制劑的篩選奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1菌種

蜜環菌：由昭通天麻生產基地提供。

1.2培養基

蜜環菌培養基：瓊脂15 g/L，馬鈴薯200 g/L，K2HPO43 g/L，MgS041.5 g/L，葡萄糖45 g/L，維生素B10.05 g/L，酵母粉3 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3主要儀器

D3024臺式高速微量（冷凍型）離心機：大龍創新實驗儀器（北京）有限公司；BD-30生物顯微鏡：深圳市博視達光學儀器有限公司；GZ-250-HSH恒溫恒濕培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司。

1.2方法

1.2.1蜜環菌生長培養基的優化

切取約0.5 cm3大小的供試菌株菌塊接種于裝有20 mL加富型固體PDA瓶裝培養基中。25℃恒溫培養30 d。待培養基內長滿白色粗壯菌索后待用。

參考彭述敏等[5]、程顯好等[6]的單因素營養條件篩選結果，選取葡萄糖，酵母浸粉和維生素B1作為研究因素。設計三因素三水平的正交試驗，見表1。

表1　L9（34）正交試驗的因素及水平Table 1　The factors and levels of L9（34）orthogonalexperimen

按表1進行試驗，每個試驗號做3個平行。滅菌后每20 mL培養基倒入直徑為9 cm培養瓶中。每一個培養瓶中接種約1 cm3的蜜環菌菌種塊。在裝液量為20 mL/瓶（直徑為9 cm的培養瓶），接種量為1 cm3/瓶，溫度為25℃，恒溫培養13 d后測定蜜環菌干重。

1.2.2密環菌培養基中雜菌的分離

從被雜菌污染的密環菌培養基中挑取雜菌菌斑，在無菌條件下，接種到盛有25 mL無菌生理鹽水中，在150 r/min、30℃條件下振蕩30 min，再以無菌生理鹽水進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋，分別取各梯度稀釋液0.1 mL涂布于含有100 mg/mL頭孢霉素以及10滴/L的25%乳酸的PDA培養基上，同時做平行和空白對照，然后在28℃恒溫條件下倒置培養3 d。挑取優勢單菌落純化（劃線3次以上）后接種到試管斜面于4℃冰箱保存備用[7-10]。

1.2.3形態學特征鑒定

將篩選得到的菌株接種到加富PDA培養基上，28℃插片培養3、5、7、15 d后，通過光學顯微鏡分別觀察氣生菌絲及基內菌絲發育情況[11-13]。

1.2.4雜菌基因組DNA的提取及rDNA-ITS菌種鑒定

采用CTAB法提取菌絲體基因組總DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測，再用紫外分光光度計定量檢測[14]。

采用rDNA-ITS序列分析技術對雜菌進行分子鑒定。采用rDNA-ITS的PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10 mmol/L dNTPs 2μL，25 mmol/L MgCl22μL，5 U/μL Taq DNA酶0.3μL，10μmol/L ITS5/ITS4引物各1μL，17 ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O 14.2μL，反應總體積為25μL。94℃預變性1 min后；92℃變性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后于72℃補平5 min，終止溫度為4℃。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測rDNA-ITS的PCR擴增產物，用凝膠圖像分析儀攝取擴增圖譜。然后用DNA凝膠回收試劑盒從1.2%的瓊脂糖凝膠中回收ITS的PCR擴增片段，并用DNA/RNA紫外分光光度計（GeneQuant Pro，GE Healthcare公司）檢測濃度。將擴增后的DNA送往上海杰李生物有限公司測序，測序結果進行BLAST比對及構建系統發育樹確定菌株分類[15-16]。

2　結果及分析

2.1正交試驗結果

正交試驗結果及結果分析見表2、表3。

表3顯示，在蜜環菌培養基優化的試驗中，極差RA>RC>RB，所以影響蜜環菌菌索生長因素的主次順序為A（葡萄糖）、C（維生素B1）、B（酵母粉）。方差分析結果（表3）顯示葡萄糖的含量對菌索的生長影響顯著。

表2　L9（34）正交試驗結果Table 2　The resultoforthogonalexperiment

表3　方差分析結果Table 3　The analysis ofvariance

由表2可知，蜜環菌菌株生長的最優方案為A3B3C1。方差分析結果顯示僅葡萄糖對蜜環菌菌索生長具有顯著影響，且顯著性影響：A>C>B，因此蜜環菌菌索生長培養基的最佳配方為A3B3C1。

2.2雜菌分離結果

通過平板法從30瓶被污染的蜜環菌培養基中篩選得到了兩種比較常見的雜菌，分別命名為t1和t2，結果見圖1。

圖1　蜜環菌培養基中雜菌的固態培養特征Fig.1　The characteristics ofmixed bacteria in the solid state culture of armillaria medium

2.3雜菌形態學特征鑒定結果

將菌株t1，t2通過劃線的方法接種到加富PDA培養基上，28℃恒溫培養5 d察菌落形態，再采用插片法培養7 d，顯微鏡觀察菌絲形態，結果見圖2。

圖2　雜菌顯微鏡下觀察特征Fig.2　Microscope characteristics of miscellaneous bacteria

在加富PDA培養基中，28℃培養5 d后，觀察到菌落并在顯微鏡下觀察菌絲體。t1形態學鑒定：菌落絨狀，厚實，中央呈淺灰綠色，反面為暗黃色，表面有顆粒狀物質，具有放射狀皺紋。顯微鏡下觀察菌絲有橫隔，分生孢子梗頂端不膨大，無頂囊，經多次分支產生對稱或不對稱的小梗，梗頂端產生成串的青色分生孢子。

t2形態學鑒定：菌落為暗黑褐色，粉末狀，稍有放射狀溝紋，反面顏色為黃褐色。顯微鏡觀察分生孢子的頂囊為球形或近球形，小梗雙層，第一層粗大，第二層短小，呈放射狀排列，布滿整個頂囊，黑色，頂端有鏈形孢子。

通過形態學特征可以初步判定t1為青霉，t2為黑曲霉。

2.4系統發育樹的構建

將菌株t1、t2的18SrDNA進行擴增，擴增結果見圖3。

圖3　PCR擴增產物電泳圖Fig.3　The electrophoresis of PCR products

擴增后后測序，結果在NCBI上進行Blast同源性比對，比對結果顯示t1與Penicillium citrinum MSSRFIS1﹙HQ232482.1﹚相似度為99%，t2與Aspergillus tub－ingensis F4-0（JN561261.1）相似度為99%。根據比對結果篩選出相似度較高（>97%）的16SrDNA序列，以Clustal軟件進行序列比對，采用Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹，結果見圖4、圖5。

圖4　采用Neighbor-Joining（NJ）法構建t1的16SrDNA系統進化樹Fig.4　Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16SrDNA sequence alignment oft1

圖5　采用Neighbor-Joining（NJ）法構建t2的16SrDNA系統進化樹Fig.5　Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16SrDNA sequence alignmentof t2

由圖4、圖5可知，菌株t1與Penicillium citrinum MSSRF-IS1﹙HQ232482.1﹚處于同一聚類分支上，且分支置信度為65%，可以確定菌株t1屬于桔青霉屬，將該菌株命名為Penicillium citrinum t1。菌株t2與Aspergillus tubingensis F4-04（JN561261.1）處于同一聚類分支上，且分支

置信度為65%，菌株t2屬于黑曲霉屬，將其命名為Aspergillus tubingensis t2。

3　結論

蜜環菌是天麻無性繁殖生長階段的關鍵因素，蜜環菌的生長與天麻產量息息相關，本對蜜環菌的生長培養基優化結果表明：葡萄糖45 g/L、酵母粉9 g/L、維生素B1為0.05 g/L最適宜蜜環菌的生長。對影響蜜環菌生長的雜菌的分離及鑒定結果表明：影響蜜環菌生長的主要菌株為黑曲霉和青霉。

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Armillaria Growth Medium Optimization and the Separation of Mixed Bacteria Identification

LIZai-xin，TANG Wen-cai
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to improve the yield of Armillaria，glucose，yeast powder，vitamin B1three components were optimized by the method of orthogonal experiment.The end of plate method was used to isolate the main bacterial and affect the growth of Armillaria strains of pollution by using molecular biology method.The results showed that the glucose 45 g/L，yeast powder 9 g/L，vitamin B10.05 g/L as the best formula.Two strains of the mold were isolated and identified，the results showed thatthe one was Penicillium citrinum t1，the other was Aspergillus tubingensis t2.

Armillaria；the orthogonalexperiment；rDNA-ITS strain identification；screening

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.036

李再新（1972—），男（漢），教授，博士，主要從事生物制藥方面的研究。

2015-06-04