熒光免疫層析檢測牛奶中的生物素含量

劉海英（內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古呼和浩特010070）

熒光免疫層析檢測牛奶中的生物素含量

劉海英
（內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古呼和浩特010070）

以熒光微球作為新型標記物，采用EDC/NHS兩步法偶聯，制備熒光微球鏈霉親合素復合物。復合物顆粒均一、性質穩定。以其作為探針，建立檢測牛奶中生物素含量的熒光免疫層析法。本方法特異性良好，最低檢出限低至3 ng/mL，線性范圍5 ng/mL～100 ng/mL，回收率90%～110%，精密度CV＜10%；與微生物法對比，測值相關系數為0.975。

熒光微球；探針；最低檢出限

生物素，又稱維生素H，是一種水溶性B族維生素，廣泛應用于醫藥、生物學、飼料添加劑以及食品等方面。另外，生物素在保健品制劑以及發酵工業中，也得到了廣泛的應用[1]。生物素是乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰CoA羧化酶和3-甲基巴豆酰CoA羧化酶4種羧化酶輔酶成分[2]。生物素對動物體基因的表達、蛋白的合成與轉運具有重要的意義[3]；參與機體免疫應答反應[4]等。

食品中生物素的檢測，以往文獻報道方法主要包括微生物法[5-6]、高效液相法[7]、酶聯免疫法[8]等，但這些方法存在操作繁瑣、或準確度不高、或靈敏度較差、或儀器要求較高等缺點。

熒光微球是一種受激發光源激發能發出熒光的固體微粒，通常的制備方法是將熒光染料通過物理或化學方法吸附或包埋到粒子內，其直徑一般在0.01μm～ 10μm范圍內。得益于熒光微球的發光強度隨著激發光強度增強而增強，熒光微球標記能夠提高免疫層析技術的檢測限。熒光微球的表面電荷的互相作用，使其形態結構相對穩定，粒度均一性高、單分散性好、發光效率高以及具有有較好的生物相容性[9]。微球形成后其熒光猝滅大大減少，不受外界環境介質變化的影響[10]，熒光強度高而穩定。因此，以熒光微球作為標記物的免疫層析技術具有較高的研究價值與技術前景。基于此，本研究采用熒光微球作為標記物，建立一種快速檢測牛奶中生物素含量的方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原材料與試劑

生物素：sigma公司；鏈霉親合素：艾美捷科技有限公司；抗鏈霉親和素抗體：上海寶曼生物科技有限公司；生物素-BSA抗原：上海瑞齊生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）：AMRESCO公司；NC膜：Millipore公司；熒光微球：Invitrogen公司；EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽）、NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）：阿拉丁試劑。

1.1.2儀器與設備

BIO DOT XYZ3050點噴系統：美國BIO DOT公司；HGS510全數字化的高速斬切機：杭州峰航科技有限公司；Sorvall RC-6 Plus冷凍離心機：Thermo Scientific公司；DHG-9140（A）干燥箱：金壇市精達儀器制造有限公司；MS2000粒度分析儀器：英國馬爾文儀器有限公司；Microdetection熒光讀數儀：南京微測生物科技有限公司。

1.2熒光微球免疫層析方法的建立[11]

1.2.1熒光微球標記鏈霉親合素

膠乳微球0.2 mL，加入50 mmol/L的MES緩沖液4.8 mL，混勻加入與熒光微球表面羧基含量等摩爾量的EDC與NHS，37℃反應30 min，分別緩慢加入鏈霉親合素50、75、100μg，4℃緩慢攪拌過夜，4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 mL含1%BSA的pH=7.4的PBST緩沖液重懸，超聲3 min，37℃攪拌2 h，置于4℃保存備用。

取偶聯前的熒光微球與偶聯后的熒光微球，用粒度分析儀器分析其zata電位、平均粒度直徑以及多分散性指數（PDI）。

1.2.2熒光微球結合墊制備

取1.2.1所得到的3種不同鏈霉親合素濃度標記的熒光微球，以10μL/cm的噴涂量用點噴系統噴涂到結合墊上，在30℃的干燥箱中干燥4 h，得到3種標記濃度的結合墊，干燥備用。

1.2.3NC膜處理與制備

將生物素-BSA抗原以及抗鏈霉親和素抗體分別于NC膜的適當位置用點噴系統進行劃線，得到T線（檢測線）與C線（質控線）。在30℃的干燥箱中干燥2 h，備用。將上述NC膜分別浸入1%BSA、1%OVA中進行封閉30 min，然后洗滌干凈，30℃的干燥箱中干燥2 h，保存備用。

1.2.4試紙條組裝

在干燥環境中，按照樣品墊、結合墊、NC膜、吸水墊的順序，取1.2.2所得到的3種不同濃度的結合墊與1.2.3所得到的未封閉、BSA封閉、OVA封閉的NC膜，依次黏貼于PVC墊板上。用高速斬切機切成4 mm寬的試紙條，組裝上外殼，真空包裝機干燥保存。

將組裝好的試紙條分別加入濃度為0、100 ng/mL的標準品，用免疫熒光分析儀讀數，得到T線與C線的峰面積（peak area，PA），計算PA0ng/mL/PA100ng/mL。

1.3熒光微球免疫層析方法的評價

1.3.1最低檢測限

以濃度為0 ng/mL的標準品重復測定20次，計算PA均值x與標準差s，以x-2s作為最低檢測限，代入標準曲線求出對應濃度。

1.3.2線性范圍

以一定濃度的樣品進行稀釋，至少5個梯度（xi），用試紙條進行測試，每個測試3次重復，分別求出測定結果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）為自變量，以測定結果均值（yi）為因變量求出線性回歸方程。按公式（1）計算線性回歸的相關系數r。

用稀釋濃度（xi）代入求出線性回歸方程，計算yi的估計值，及yi與估計值的相對偏差或絕對偏差。

1.3.3準確度[12]

采用回收試驗，在樣品中加入一定體積的標準溶液（標準溶液的體積不會產生基質的變化，加入標準溶液然后濃度依然在線性范圍之內），每個濃度重復測定3次，按公式2計算回收率R。

式中：R為回收率，%；V為加入標準品的體積，mL；V0為樣品體積，mL；C為樣品加入標準品后的測定濃度，ng/mL；C0為樣品的測定濃度，ng/mL；CS為標準品濃度，ng/mL。

1.3.4精密度

定標后平行測試高值與低值樣本各10次，計算測定均值（x）和標準差（s），按照公式（3）計算變異系數。

1.3.5特異性

特異性可用交叉反應率來表示。交叉反應率即引起50%抑制的生物素標準物濃度（生物素IC50）與引起50%抑制的生物素類似物濃度（生物素相似物IC50）值之比。本試驗測定該方法與葉酸、VB12、VB1、VB2、VC等的交叉反應率。

1.3.6測值相關性

本方法與對照方法（微生物法）同步檢測50例樣本，分析兩者測值相關性。

1.3.7牛奶樣本生物素本底測定

用本法檢測市售樣本中生物素含量，并分析其分布規律、趨勢。

1.4數據分析

采用origin 8.0進行作圖與數據的分析，以α=0.05作為差異顯著性水平。

2　結果與分析

2.1偶聯前后熒光微球的表征

采用粒度分析儀器分析膠乳微球在偶聯鏈霉親合素前、后的粒徑及zata電位的變化，結果見圖1、圖2。

圖1　偶聯前后熒光微球粒徑變化Fig.1　The change in particle size before and after coupling

圖2　偶聯前后熒光微球zata電位變化Fig.2　The change in zata potentialbefore and after coupling

由圖1可知偶聯前熒光微球的平均直徑為95.33nm，偶聯之后熒光微球的平均直徑增加到112.25 nm。由圖2可知，偶聯前、后的熒光微球均帶有負電荷，其zata電荷強度分別為-44.8、-32.9 mV，并且其電位的強度相對時間均保持穩定狀態。熒光微球偶聯鏈霉親合素前多分散性指數（PDI）為0.024，偶聯之后PDI為0.045。zata電荷強度與PDI數據表征所用的熒光微球在偶聯前、后均顆粒均一、性質穩定；微球粒徑數據表征偶聯之后粒徑增加，蛋白偶聯成功。

2.2偶聯熒光微球及NC膜封閉工藝參數的篩選結果

本方法基于樣本中的生物素與結合于NC膜T線的生物素競爭結合熒光微球上偶聯的鏈霉親合素（抗生物素蛋白）。鏈霉親合素偶聯量的高低影響著試紙條的性能指標。NC膜是多孔性網狀結構膜，生物大分子及較大顆粒在NC膜上層析過程中可能與膜發生非特異性吸附[11]。因此采用封閉劑進行NC膜的封閉是降低這種非特異性吸附的有效手段，本試驗設計了50、75、100μg 3種蛋白偶聯量以及未封閉NC膜、BSA封閉、OVA封閉3種不同的NC膜處理方式共9組試驗驗證蛋白偶聯量及封閉工藝對熒光微球在NC膜上涌動性能的影響，見表1。

表1　不同的偶聯及封閉工藝的試驗結果Table 1　The results ofdifferentcoupling and blocking crafts

由表1可以看出，當封閉工藝一致時，隨著偶聯蛋白濃度的提高，PA0ng/mL與PA100ng/mL均呈現升高的趨勢；當偶聯蛋白濃度一致時，PA0ng/mL與PA100ng/mL高低順序依次為未封閉≥1%OVA封閉≥1%BSA封閉；當蛋白偶聯量為75μg，采用1%OVA進行封閉時，試紙條檢測100 ng/mL標準品具有最低的PA值（非特異性反應最低）且具有最高的N/P（PA0ng/mL/PA100ng/mL=28.33）。因此選擇蛋白偶聯量75μg，采用1%OVA進行NC膜封閉工藝。

2.3熒光微球免疫層析方法的性能評價結果

2.3.1定標曲線

熒光微球免疫層析方法的定標曲線見圖3。

圖3　熒光微球免疫層析方法的定標曲線Fig.3　The calibration curve of the immunofluorescence chromatography method

以生物素濃度為自變量，以熒光強度（PA）為因變量，采用指數擬合得到擬合曲線函數為y=-6 284.5+ 1 218 420×e-0.03006x，r=0.998，P＜0.05，擬合曲線良好。

2.3.2最低檢出限與線性范圍

0 ng/mL標準品重復測定20次，得到的PA均值x=1 225 000，標準差s=59 600，x-2s=1 107 000，代入2.3.1所得到的標準曲線計算出對應的生物素濃度為3 ng/mL，即為最低檢出限。

線性范圍測定結果見圖4。

圖4　熒光微球免疫層析方法線性范圍測定結果Fig.4　The linear range of the immunofluorescence chromatography method

由圖4可以得出，本方法在5 ng/mL～100 ng/mL范圍內，相關系數r2=0.999 48，線性相關性良好。

2.3.3準確度

選取5組樣品進行回收試驗，試驗結果見表2。

表2　熒光微球免疫層析方法回收試驗測定結果Table 2　The recovery test results ofthe immunofluorescence chromatography method

由表2可知，5組樣品回收率均在90%～110%之間，準確度良好。

2.3.4精密度與特異性

采用高低值兩樣本重復測定10次，高值樣本與低值樣本CV≤10%（低值樣本：CV=3.65%；高值樣本：CV=1.17%）。熒光微球免疫層析方法特異性測定結果見表3。

表3　熒光微球免疫層析方法特異性測定結果Table 3　The specificity test results of the immunofluorescence chromatography method

由表3可以看出，本方法與葉酸、VB12、VB1、VB2、VC的交叉反應率均＜0.1%，特異性良好。

2.3.5測值相關性

與對照方法同步檢測50例樣本，分析結果見圖5。

圖5　熒光微球免疫層析方法與比對方法測值相關性分析Fig.5　The correlation analysis between the immunofluorescence chromatography method and the comparison method

由圖5可知，本研究方法與比對方法相關曲線為y=0.986 6x-0.250 8，相關系數r2=0.950 11，測值相關性良好。

2.3.6市售牛奶樣品生物素本底測定

用本法進行100例市售牛奶樣本生物素含量檢測，其含量范圍為7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，均值29.3 ng/mL，中位數29.6 ng/mL，100例牛奶樣品中生物素測定結果見圖6。

圖6　100例牛奶樣品中生物素測定結果Fig.6　The biotin concentration of100 milk samples

由圖6可知，生物素濃度在25 ng/mL～35 ng/mL的樣品具有最高的頻數（共43例），生物素濃度超過50 ng/mL的樣品數量極少（2例），生物素濃度低于10 ng/mL的樣品僅1例。

3　討論

在生物素的測定方法中，微生物法是最為靈敏和應用最為廣泛的，主要用于生物素的微量檢測。其原理是在一定條件下，生物素的濃度與菌體的生長量及生長速度呈線性關系。微生物法是GB/T 5413-2010《食品安全國家標準嬰幼兒配方食品和乳粉游離生物素的測定》[13]仲裁法，也是現今美國政府機構的實驗室和FDA一直在用的方法。但由于其檢驗周期長，操作較復雜，試驗工作量大，對人員技術要求較高，從而難以推廣。殷曉紅等[14]用該法測定嬰兒配方食品中生物素含量，方法重現性好，變異系數為3.34%，平均回收率為97%，回收范圍為88.5%～110.0%。

近年來，HPLC法應用于生物素的測定的報道較多。肖晶等[7]用HPLC法測定保健食品中的生物素，檢出極限為0.5 mg/kg，回收率在87%～102%之間。鄧富良等[15]用HPLC測定注射用水溶性維生素中的生物素，檢測限為0.5 ng（20μL），線性范圍為0.25μg/mL～25.14μg/mL，平均回收率在99.35%以上。HPLC法測定生物素，簡便、快速、靈敏度高、重復性好、適應性好，但對某些成分復雜、色素較多、雜質干擾大的樣品，不宜用該法檢測。

本研究對生物素含量的檢測采用熒光微球免疫層析方法。熒光微球等發射光譜型標記物因信號強度可隨激發光增強而增強，因此可以有效降低層析方法的檢測限。本試驗以EDC/NHS介導的兩步法偶聯合成了適用于免疫層析檢測的熒光微球探針。熒光微球探針粒度均一、化學及光學性質穩定。以此建立的以生物素為目的物的免疫層析檢測方法，最終檢測限可達3 ng/mL，靈敏度高于微生物法及HPLC法。

本研究采用競爭法。結合于NC膜T線的生物素與待測樣品或者標準品中的生物素競爭結合熒光微球標記的鏈霉親合素，生物素含量的高低與熒光強度的強弱成反比。由于鏈霉親合素僅特異性的親和生物素，因此與樣品中的其它生物素類似物如葉酸、VB12VB1、VB2、VC均無非特異性的交叉反應，從而保證了生物素含量的準確測定。

本研究采集了市售的50例牛奶樣本，同時采用本方法與微生物方法進行測值相關性分析，試驗結果表明，本方法與微生物方法具有良好的線性相關性。另外，收集市售100例樣品進行樣品濃度的測定發現，生物素含量范圍為7.5 ng/mL～51.0 ng/mL，含量均值29.3 ng/mL，這與劉志楠等[16]的研究結果具有一致性。

本研究的創新性在于采用熒光微球免疫層析方法，有效的降低了生物素檢出限，極大地縮短了樣品測定的時間，另外采用基于生物素鏈霉親合素特異性結合的競爭法，有效的降低生物素類似物的非特異性反應。本方法有利于乳品企業快速的檢測牛奶中生物素的本底含量，指導進行生物素的合理添加。

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Immunofluorescence Chromatography for Detecting Biotin in Milk

LIU Hai-ying
（Food Engineering Departmentof Inner Mongolia Business&Trade VocationalCollege，Hohhot010070，Inner Mongolia，China）

A composition with a character and uniform size which contained fluorescentmicrospheres as a novel lable was obtained by an EDC/NHS two-step method.The biotin in milk was detected by the immunofluorescence chromatography which had this compositoin as a probe.The method showed good specificity with the detection limitof3 ng/mL，the linear range of 5 ng/mL-100 ng/mL，the recovery of90%-110%and the precision CV less than10%；the correlation coefficient of measuring value was 0.975 compared with microbiological method.

fluorescentmicrospheres；probe；detection limit

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.032

劉海英（1981—），女（蒙古），講師，碩士研究生，研究方向：食品加工技術。

2016-03-04