混料設計法優化紅棗汁乳酸發酵菌種配比研究

趙叢枝，范改敬，梁爽，張子德（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

混料設計法優化紅棗汁乳酸發酵菌種配比研究

趙叢枝，范改敬，梁爽，張子德*
（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

以紅棗發酵液的乳酸含量和活菌數為指標，選擇嗜酸乳桿菌（NCFM）、干酪乳桿菌（D400）、植物乳桿菌（121）和嗜熱鏈球菌（St）作為發酵菌種，利用混料設計法優化菌種配比。建立了各菌種配比與發酵液活菌數和乳酸含量的數學回歸模型，并對此進行分析和預測，得出各菌種最佳體積比為：干酪乳桿菌（D400）∶嗜酸乳桿菌（NCFM）∶植物乳桿菌（121）=1∶1∶2，此時活菌數為1.81×109CFU/mL，乳酸含量為6.31 g/L。

混料設計；紅棗汁；乳酸菌；發酵

紅棗（Ziziphus jujube Mill）別名大棗、刺棗、膠棗等，是鼠李科棗屬植物的成熟果實。紅棗原產于我國，現在已有3 000多年的種植歷史，與李、杏、桃、栗并稱為中國的“五果”[1]。目前，我國紅棗種植主要集中在河北、山東、陜西、新疆、山西、河南、遼寧、甘肅、寧夏和天津等地[2-3]，紅棗品種共有700多個，其中重要的品種有金絲小棗、阿克蘇紅棗、若羌灰棗、和田玉棗、陜北有機紅棗、臨澤小棗、柳林木棗以及河北的贊皇大棗等。

紅棗的營養成分含量很高，所以有“木本糧食，滋補佳品”的稱號。近代研究發現，紅棗中還含有豐富的生理活性成分[4-6]，如紅棗多糖、酚類物質、三萜類物質、環核苷酸、皂苷、生物堿等，多食用紅棗能夠起到補氣養血、增強機體免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、保護肝臟、軟化血管、降血壓等功效。

中國是紅棗的原產地，也是紅棗出口大國，但就目前而言，紅棗粗加工產業居多，產品附加值低，技術含量低，規模較小，所以今后紅棗加工應向精深加工邁進，不斷提高技術水平，提高原料利用率減少損耗，降低成本從而增加紅棗的經濟效益。

利用乳酸菌制作發酵乳制品在全世界范圍內都具有悠久的歷史，但近些年來在其他食品原料加工中的應用越來越多。果汁經過乳酸菌發酵后，不僅可以提高營養價值，還能產生清爽的口感。混料設計是研究配料中各組分比例的試驗設計方法，應用于多種領域，近年來在食品工業上的應用越來越廣泛[7-9]。本試驗利用混料設計法，優化紅棗汁乳酸發酵菌種的配比，以得到紅棗汁乳酸發酵劑中各菌種的最佳組合。

1　材料與方法

1.1材料

紅棗：試驗所用紅棗品種為和田玉棗，市售，干棗，無霉爛。

菌種：試驗所選8株乳酸菌均來自于河北農業大學微生物實驗室，分別為嗜熱鏈球菌（St）、嗜酸乳桿菌（NCFM）、干酪乳桿菌（Y5-2b）、干酪乳桿菌（D400）、植物乳桿菌（121）、保加利亞乳桿菌（Lb）、德氏乳桿菌（5MI）、鼠李糖乳桿菌（lackid）。

1.2試劑與設備

1.2.1試驗試劑

果膠酶、纖維素酶：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2.2儀器與設備

生化培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；pB-10 型pH計：北京賽多利斯儀器系統有限公司；AR423CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；THZ-82電子恒溫水浴振蕩器：江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；JYL-C012料理機：九陽股份有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1紅棗汁的制備

取一定量的紅棗蒸煮5 min后，加入6倍的水進行打漿，于80℃下浸提90 min，按照重量比加入果膠酶∶纖維素酶=2∶1的混合酶0.16%，于50℃酶解2.1 h。將棗汁分裝試管，于121℃下滅菌15 min用于乳酸菌的馴化和活化；將棗汁分裝在錐形瓶中，于85℃下滅菌15 min用于乳酸菌發酵。

1.3.2發酵菌種的馴化及確定

1.3.2.1發酵菌種的馴化

由于所用的8株乳酸菌均不是來自紅棗，所以在接入純棗汁之前，需要對乳酸菌進行梯度馴化，以便使其逐步適應純棗汁的營養條件。具體做法為，先將所用菌種用復原乳培養基進行活化，然后逐步接入體積比為純棗汁∶復原乳=1∶9、3∶7、6∶4、8∶2、10∶0的復合培養基中，37℃條件下培養17 h。

1.3.2.2發酵菌種的確定

將馴化好的8株乳酸菌按照4%的接種量分別接種到純棗汁中，在37℃恒溫箱中培養17 h后測定最終紅棗汁的活菌數和產酸量（以乳酸計），選出3株～5株發酵性能較好的菌株。

選取4株發酵性能較好的菌株，借助試驗設計軟件Design-Expert8.0.6，采用混料設計中的單純形重心設計[10-12]，以發酵后的活菌數和產酸量（以乳酸計）為響應值，優化發酵菌種的配比，試驗因素水平如表1。

1.3.4試驗指標測定方法

1）總酸的測定：GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，并換算為乳酸含量；

表1　試驗因素水平表Table 1　Factors and levels ofexperiment

2）活菌數的測定[13]：采用平板菌落計數法，于37℃下培養48 h。

2　結果與分析

2.1發酵菌種的確定

不同乳酸菌發酵結果見表2。

表2　乳酸菌發酵后活菌數及乳酸產量Table 2　The living bacteria number and acid yield after fermentation

由表2可知，8株乳酸菌在純棗汁中均可發酵產酸，這是因為8株菌都可以利用紅棗中所含的葡萄糖和果糖進行發酵，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌還可以利用紅棗中含有的少量蔗糖。發酵結果表明，8株菌發酵后活菌數均可達到106CFU/mL以上，乳酸含量差別較大。

在教授的過程中，教師通過解決問題來解釋數學思想，數學應用方法解決了數學問題.老師反映思維活動，學生掌握了以自己的邏輯思維生活的能力，發現數學的樂趣，找到解決問題的最佳解決方案.教學問題解決過程通過分析向學生講授課程的方法.通過不斷的學習，總結和理解數學思維方法.在高中數學教育過程中，教師需要通過教授學生的知識和技能，有效地提高學生的學習效率，并將數學思想無形地嵌入學生中.

其中，嗜酸乳桿菌NCFM在純棗汁中發酵后活菌數和乳酸含量最高，分別達到1.20×109CFU/mL和4.97 g/L，顯著高于其他菌株。干酪乳桿菌D400、植物乳桿菌121和嗜熱鏈球菌St三株菌發酵后活菌數都達到了108CFU/mL以上，相互之間差異顯著（P＜0.05），乳酸含量均在4.4 g/L以上。另外上述4種菌屬于不同菌種，在發酵純棗汁過程中可以表現出不同的發酵特性，充分利用紅棗中的營養成分，得到更好的產品，所以本試驗選取嗜酸乳桿菌（NCFM）、干酪乳桿菌（D400）、植物乳桿菌（121）和嗜熱鏈球菌（St）作為發酵菌種。

2.2發酵菌種配比的優化研究

2.2.1混料設計優化結果

以A（St嗜熱鏈球菌）、B（D400干酪乳桿菌）、C （NCFM嗜酸乳桿菌）和D（121植物乳桿菌）為自變量，總接種量為4%，以乳酸含量和活菌數為因變量，混料設計試驗方案及結果見表3。

表3　混料設計方案及結果Table 3　Program and resultofmixture design

2.2.2乳酸含量和活菌數模型的建立及方差分析

通過統計分析軟件Design-Expert.V8.0.6對試驗結果進行數據分析，分別建立活菌數R1和乳酸含量R2的回歸模型方程如下：

R1=1.189×108A+3.604×108B+5.771×108C+2.170× 108D+2.108×109AB+3.421×109AC+2.238×109AD+4.996× 109BC+4.785×109BD+2.828×109CD；

R2=4.46A+4.69B+4.87C+4.58D+2.23AB+4.16AC+ 2.47AD+5.29BC+5.32BD+3.35CD

活菌數方差分析結果見表4。

由表4可知該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.275 7）。該模型方程的確定系數R12=0.973 2，校正后R1Adj2=0.956 0，說明該模型能很好的擬合紅棗汁發酵液活菌數與菌種配比的關系。通過F值和P值可知，4個因素之間交互作用顯著，并且作用大小為BC＞BD＞AC＞CD＞AB＞AD，即B（D400干酪乳桿菌）和C （NCFM嗜酸乳桿菌）的交互作用對活菌數影響最顯著。

表4　活菌數回歸方程的方差分析表Table 4　ANOVA for regression equation ofliving bacteria number

乳酸含量方差分析結果見表5。

表5　乳酸含量回歸方程的方差分析表Table 5　ANOVA for regression equation of acid yield mode

由表5可知該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.209 7）。確定系數R22=0.987 3，校正后R2Adj2=0.979 1，說明該模型能很好的擬合紅棗汁發酵液乳酸含量和菌種配比的關系。通過F值和P值可知，4個因素之間交互作用顯著，并且作用大小為BD＞BC＞AC＞CD＞AB＞AD，乳酸含量與活菌數方差分析結果一致，即B（D400干酪乳桿菌）和D（121植物乳桿菌）的交互作用對活菌數影響最顯著。

2.2.3乳酸含量和活菌數模型交互項的響應曲面圖分析

混料設計中，各因素的變化及相互作用對結果的影響可以從等高線圖和曲面圖中看出，在本試驗中固定其中一個因素，可以比較其他因素的變化對紅棗汁發酵液的乳酸含量和活菌數的影響。圖1為菌種D（121植物乳桿菌）固定時，A（St嗜熱鏈球菌）、B（D400干酪乳桿菌）、C（NCFM嗜酸乳桿菌）對紅棗汁發酵液活菌數的影響；圖2為菌種A（St嗜熱鏈球菌）固定時，B（D400干酪乳桿菌）、C（NCFM嗜酸乳桿菌）和D（121植物乳桿菌）對紅棗汁發酵液活菌數的影響。圖3為菌種D （121植物乳桿菌）固定時，A（St嗜熱鏈球菌）、B（D400干酪乳桿菌）、C（NCFM嗜酸乳桿菌）對紅棗汁發酵液乳酸含量的影響；圖4為菌種A（St嗜熱鏈球菌）固定時，B（D400干酪乳桿菌）、C（NCFM嗜酸乳桿菌）和D（121植物乳桿菌）對紅棗汁發酵液乳酸含量的影響。

圖1　菌種A、B、C對活菌數影響的等高線和曲面圖Fig.1　Response surface plotand contour plot of the effect ofbacterial A，B，C on living bacteria number

圖2　菌種B、C、D對活菌數影響的等高線和曲面圖Fig.2　Response surface plot and contour plotofthe effect of bacterial B，C，D on living bacteria number

圖3　菌種A、B、C對乳酸含量影響的等高線和曲面圖Fig.3　Response surface plot and contour plotofthe effectof bacterial A，B，C on lactic acid yield

圖4　菌種B、C、D對乳酸含量影響的等高線和曲面圖Fig.4　Response surface plot and contour plotofthe effectof bacterial B，C，D on lactic acid yield

由圖1～圖4可知，等高線圖均為橢圓形，所以4種菌的交互作用對活菌數和乳酸含量有顯著影響。分析圖1、圖2可知，隨著D400干酪乳桿菌比例的增加，活菌數增加較快，所以干酪乳桿菌對活菌數的影響最大，當其水平為0.462時，活菌數有最大預測值1.816 2× 109CFU/mL。121植物乳桿菌、NCFM嗜酸乳桿菌對活菌數也有顯著影響，St嗜熱鏈球菌對其影響最小。分析圖3、圖4可知，D400干酪乳桿菌對乳酸含量的影響最大，其水平為0.400時，乳酸含量有最大預測值6.292 15 g/L。121植物乳桿菌、NCFM嗜酸乳桿菌對乳酸含量也有顯著影響，St嗜熱鏈球菌對其影響最小。

2.2.4驗證試驗

利用軟件的最優化功能得到了28個菌種配比和預測值，如表6所示。

表6　菌種配比及預測結果Table 6　Proportions of bacterium and predicted results

續表6 菌種配比及預測結果Continue table 6　Proportions ofbacterium and predicted results

從中選取了響應值較高的一組，當A（St嗜熱鏈球菌）∶B（D400干酪乳桿菌）∶C（NCFM嗜酸乳桿菌）∶D （121植物乳桿菌）=0.000∶0.400∶0.358∶0.243時，活菌數和乳酸含量最高，分別為1.82×109CFU/mL，6.29 g/L。為了方便操作調整為B∶C∶D=1∶1∶2，進行了5次驗證試驗，得到活菌數為1.81×109CFU/mL，乳酸含量為6.31 g/L，與預測結果基本一致，所以軟件得到的結果具有實際意義。

3　結論

本試驗以紅棗發酵液的乳酸含量和活菌數為指標，確定了發酵菌種為嗜酸乳桿菌（NCFM）、干酪乳桿菌（D400）、植物乳桿菌（121）和嗜熱鏈球菌（St）。利用混料設計優化菌種配比，得出R1乳酸含量和R2活菌數對A（St嗜熱鏈球菌）、B（D400干酪乳桿菌）、C （NCFM嗜酸乳桿菌）和D（121植物乳桿菌）回歸模型如下：

R1=1.189 8×108A+3.604×108B+5.771×108C+2.170× 108D+2.108×109AB+3.421×109AC+2.238×109AD+4.996×109BC+4.785×109BD+2.828×109CD；

R2=4.46A+4.69B+4.87C+4.58D+2.23AB+4.16AC+ 2.47AD+5.29BC+5.32BD+3.35CD

對此進行分析和預測，得出最佳配比為干酪乳桿菌（D400）∶嗜酸乳桿菌（NCFM）∶植物乳桿菌（121）=1∶1∶2，此時活菌數為1.81×109CFU/mL，乳酸含量為6.31g/L。

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Application of Mixture Design in Study of Lactobacillus Proportion in Jujube Juice Fermentation

ZHAO Cong-zhi，FAN Gai-jing，LIANG Shuang，ZHANG Zi-de*
（College ofFood Science and Technology，Agricultural University ofHebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Viable count and lactic acid content was chosed as indicators，then selected Lactobacillus acidophilus（NCFM），Lactobacillus casei（D400），lactobacillus plantarum（121）and Streptococcus thermophilus （St），Mix design optimization was used to determine the optimal lactobacillus proportion in Jujube Juice fermentation.The regression mathematicalmodels ofthe factors on viable countand lactic acid contents were built. The optimum volume ratio were D400∶NCFM∶121=1∶1∶2，and the viable countatthis condition was 1.81× 109CFU/mL，lactic acid contentwas 6.31 g/L.

mixture design；jujube juice；lactic acid bacteria；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.023

趙叢枝（1978—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學與工程。

張子德，男（漢），教授，研究方向：農產品貯藏與加工。

2016-01-20