響應(yīng)面法優(yōu)化絞股藍(lán)皂苷微波輔助-超聲提取工藝

尤秀麗，鄭建忠，陳熔，蔡曉丹，李瓊，譚昌會(huì)（.閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建漳州363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建漳州363000）

響應(yīng)面法優(yōu)化絞股藍(lán)皂苷微波輔助-超聲提取工藝

尤秀麗1，2，鄭建忠1，2，陳熔1，蔡曉丹1，李瓊1，譚昌會(huì)1，2
（1.閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建漳州363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建漳州363000）

以絞股藍(lán)為原料，采用微波超聲雙輔助提取皂苷。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，建立二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷微波超聲雙輔助提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：微波功率400 W、超聲時(shí)間60 min、乙醇濃度80%、超聲溫度為51℃、微波時(shí)間117 s、液料比28∶1（mL/g），此條件下絞股藍(lán)皂苷提取率為7.05%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差約為0.57%，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相吻合。

響應(yīng)面法；微波超聲雙輔助提取；絞股藍(lán)；皂苷

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）又名七葉膽，甘茶蔓，為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生落葉草質(zhì)藤本植物，素有“南方人參”和“第二人參”之美稱[1]。絞股藍(lán)主要分布在我國(guó)秦嶺至淮河線以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)[2]，2002年國(guó)家衛(wèi)生部將其列為新資源藥食兩用，并將其列入保健品名單[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)皂甙（gypenosides，GPS）是絞股藍(lán)的主要有效成分，其中絞股藍(lán)皂甙Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ分別與人參皂甙Rbl、Rb3、Rd和F2是同一物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用，一直是絞股藍(lán)研究的熱點(diǎn)[5-7]。

近年來，絞股藍(lán)皂苷提取工藝有很多，如水浴法[8]、醇提法[9-11]、微波法[12-13]、酶提法[14]、超聲波[15-16]等方法。超聲波和微波提取技術(shù)又是天然產(chǎn)物提取中的新型技術(shù)[17-20]，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作快捷、適用范圍廣、提取率高、溶劑用量少、節(jié)時(shí)、節(jié)能、安全污染小等優(yōu)點(diǎn)。目前鮮見使用響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲雙輔助技術(shù)提取絞股藍(lán)皂苷的相關(guān)報(bào)道。本文利用響應(yīng)面法對(duì)微波-超聲雙輔助提取絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行優(yōu)化，采用回歸分析得到絞股藍(lán)皂苷最佳工藝條件，為絞股藍(lán)皂苷的開發(fā)應(yīng)用研究提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絞股藍(lán)，購(gòu)于漳州紫金藥店；人參皂苷Rb1（>98% HPLC）分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海純優(yōu)生物科技有限公司；無水乙醇、無水甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸，均為分析純。

XFB-200藥材粉碎機(jī)：吉首市中湘制藥機(jī)械廠；UV-1800 PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；P70D20TP-C6（WO）微波爐：廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；BS110S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；WH-200超聲波清洗機(jī)：濟(jì)寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成濃度為1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液20、40、60、80、100、120μL分別置于具塞試管中，水浴中去除甲醇，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，混勻后，密置于水浴中加熱，取出、冷卻，加入5 mL冰醋酸，相應(yīng)試劑為空白。在550 nm下測(cè)定吸光度，以人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y= 21.349x-0.034 4，R2=0.999 2。

1.3微波超聲提取絞股藍(lán)皂苷

將所購(gòu)的絞股藍(lán)置于60℃恒溫干燥箱中，待烘干后，用藥材粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得絞股藍(lán)粉末。稱取絞股藍(lán)粉末1.000 0 g，置于微波容器內(nèi)，然后設(shè)定一定的微波功率、微波時(shí)間，處理后，再加入一定量乙醇溶液作溶劑，置于超聲波器中，在一定的超聲溫度、超聲時(shí)間、液料比提取。后冷卻后過濾提取液，量其體積。取20μL提取液于具塞試管，用85℃水浴揮干提取液，采用香草醛-高氯酸比色法在波長(zhǎng)550 nm下測(cè)其吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的絞股藍(lán)皂苷提取率。

式中：C為皂苷的濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為絞股藍(lán)的質(zhì)量，g。

1.4單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以皂苷提取率為指標(biāo)，準(zhǔn)確稱取絞股藍(lán)粉末1.000 0 g，選取微波時(shí)間、微波功率、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度和乙醇濃度作為影響絞股藍(lán)皂苷微波超聲雙輔助提取的單因素，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇影響絞股藍(lán)皂苷提取率的3個(gè)主要影響因素：微波時(shí)間、料液比和超聲溫度進(jìn)行響應(yīng)面組合試驗(yàn)，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)自變量因素水平表Table 1　Variables and levels for the Box-Behnken experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1微波時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波功率400 W，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波時(shí)間30、60、90、120、150 s對(duì)皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖1。

圖1　微波時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響Fig.1　Effect of microwave time on the extraction yield ofsaponins

由圖1可知，隨著微波時(shí)間加長(zhǎng)，皂苷提取率隨之升高，當(dāng)微波時(shí)間大于120 s后，提取率反而下降，可能是因?yàn)槲⒉〞r(shí)間加長(zhǎng)，有效成分受到破壞，至使提取率下降，因此，微波時(shí)間120 s較為適合。

2.1.2微波功率對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波時(shí)間120 s，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波功率100、150、400、550、700 W對(duì)皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著微波功率從100 W增加到400 W，皂苷的提取率增加幅度較大，這可能是因?yàn)殡S著微波功率的增大，強(qiáng)大的內(nèi)壓及分子間的摩擦力使絞股藍(lán)細(xì)胞破裂，皂苷溶解速度加快，提取率升高；微波功率過大，溫度較高，皂苷有效成分易被氧化降解，從而使提取率下降。因此，試驗(yàn)選取較優(yōu)微波功率為400 W。

圖2　微波功率對(duì)皂苷提取率的影響Fig.2　Effect ofmicrowave power on the extraction yield of saponins

2.1.3液料比對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波功率400 W，微波時(shí)間120 s，乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間60 min，考察液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（mL/g）對(duì)皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3　液料比對(duì)皂苷提取率的影響Fig.3　Effectofolid-to-solventratio on the extraction yield of saponins

由圖3可以看出，隨著液料比增加，皂苷的提取率也隨之增大，當(dāng)液料比大于25∶1（mL/g）時(shí)，提取率反而下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)料液比達(dá)到一定的比例，目標(biāo)成分已提取充分，料液比若繼續(xù)升高，則對(duì)提取率的影響不大，而且溶劑量過大會(huì)增加成本及后續(xù)液體濃縮的難度，因此，試驗(yàn)選取液料比25∶1（mL/g）較為適合。

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波功率400 W，微波時(shí)間120 s，液料比25∶1（mL/g），乙醇濃度80%，超聲溫度60℃，考察超聲時(shí)間30、45、60、75、90 min對(duì)皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷提取率也隨之升高，當(dāng)超聲時(shí)間大于60 min后，提取率反而下降，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)使皂苷部分降解，因此，選取最佳超聲時(shí)間為60 min。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)皂苷提取率的影響Fig.4　Effectofultrasonic treatmenttime on the extraction yield of saponins

2.1.5超聲溫度對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波功率400 W，微波時(shí)間120 s，超聲時(shí)間60 min，液料比25∶1（mL/g），乙醇濃度80%，考察超聲溫度40、50、60、70℃對(duì)皂苷提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5　超聲溫度對(duì)皂苷提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of saponins

從圖5可見，絞股藍(lán)皂苷隨溫度的升高而提取率增大，當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，絞股藍(lán)總皂苷的提取率達(dá)到最大值；提取溫度大于50℃后，絞股藍(lán)皂苷的提取率開始下降。其原因是隨著溫度升高，加快分子運(yùn)動(dòng)速度，從而使溶出物增多、皂苷釋放加快，提取率增大；若是超聲溫度過高，雜質(zhì)溶出增加，有效成分被破壞，而使提取率下降。因此，選定50℃為最佳超聲溫度，提取率達(dá)6.91%。

2.1.6乙醇濃度對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響

當(dāng)微波功率400 W，微波時(shí)間120 s，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間60 min，液料比25∶1（mL/g），考察乙醇濃度60%、70%、80%、90%、100%對(duì)皂苷提取率的影響。結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，皂苷的提取率隨乙醇濃度的增大而增加，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)提取率達(dá)到最大，這可能是因?yàn)榻g股藍(lán)中皂苷的極性更接近濃度為80%的乙醇的極性。因此，試驗(yàn)選取乙醇的最佳濃度為80%。

圖6　乙醇濃度對(duì)皂苷提取率的影響Fig.6　Effectofethanolconcentration on the extraction yield of saponins

2.2響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果與分析

利用Design Expert7.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)[21]的試驗(yàn)條件及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為：Y=6.87-0.055A+0.33B+0.093C+0.040AB+0.23AC+ 0.23BC-0.57A2-0.42B2-1.61C2。再對(duì)該模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3　二次響應(yīng)模型方差分析Table 3　ANOVA results of the fitted quadratic regression model

續(xù)表3　二次響應(yīng)模型方差分析Continue table 3　ANOVA results ofthe fitted quadratic regression model

由表3的ANOVA方差分析可知，模型的P值< 0.01，差異極顯著，說明回歸模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型對(duì)乙醇微波超聲雙輔助提取絞股藍(lán)皂苷的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從F值可知，各因素對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取率的影響順序?yàn)椋築>C>A，即液料比﹥超聲溫度>微波時(shí)間；一次項(xiàng)B和C顯著，二次項(xiàng)A2、B2和C2極顯著，交互項(xiàng)AC、BC顯著，AB不顯著，說明二次項(xiàng)響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。

對(duì)表3的分析結(jié)果作回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面，見圖7。

圖7　AB、AC和BC分別對(duì)皂苷提取率影響的響應(yīng)面Fig.7　The response surface of AB、AC and BC on extraction yield ofchlorogenic acid

表2　RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Experimentaldesign and corresponding results for RSM

由圖7可知，響應(yīng)面都是開口朝下的拋物曲面，其中心位于試驗(yàn)考察的區(qū)域范圍內(nèi)，說明在試驗(yàn)單位內(nèi)所考察指標(biāo)存在最大值。

利用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，可得絞股藍(lán)皂苷提取的最佳工藝條件為微波時(shí)間117.12 s、液料比27.75∶1（mL/g）、超聲溫度51.24℃，在該條件下絞股藍(lán)皂苷提取率預(yù)測(cè)值為7.01%。

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性，在上述最佳工藝條件進(jìn)行絞股藍(lán)中皂苷微波超聲雙輔助提取的試驗(yàn)，平行3次，同時(shí)考慮實(shí)際操作情況，將絞股藍(lán)皂苷最佳工藝條件修正為：微波時(shí)間117 s、液料比28∶1（mL/g）、超聲溫度51℃，實(shí)際得到絞股藍(lán)皂苷提取率的平均值為7.05%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，其相對(duì)誤差約為0.57%。從而證實(shí)該模型可用于絞股藍(lán)皂苷的提取。與其他方法相比，微波超聲雙輔助提取絞股藍(lán)皂苷的提取率較高，提取時(shí)間較短。

3　結(jié)論

以絞股藍(lán)為原料，采用微波超聲雙輔助提取皂苷，通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)得到優(yōu)化的工藝參數(shù)：微波時(shí)間117 s、液料比28∶1（mL/g）、超聲溫度51℃、乙醇濃度80%、超聲溫度為60℃、超聲時(shí)間60 min，在該條件下驗(yàn)證絞股藍(lán)皂苷提取率的平均值為7.05%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明此模型用于絞股藍(lán)皂苷的提取工藝是可行的。絞股藍(lán)皂苷提取工藝經(jīng)優(yōu)化后提取率得到有效提高，可再為絞股藍(lán)的再利用提供參考。

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Optimization of Microwave-ultrasonic-assisted Extraction of Saponins from Gynostemma
pentaphyllum Using Response Surface Methodology

YOU Xiu-li1，2，ZHENG Jian-zhong1，2，CHEN Rong1，CAIXiao-dan1，LIQiong1，TAN Chang-hui1，2
（1.Colllege of Chemistry and Environment，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China；2.Fujian Province Key Laboratory of Morden Analytical Science and Separation Technology，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China）

The microwave-ultrasonic-assisted extraction ofsaponins from Gynostemma pentaphyllum was optimized using response surface methodology.Base on single-factor experiments，the extraction conditions ofmicrowave-ultrasonic-assisted extraction yield of saponins in the Gynostemma pentaphyllum were by RSM.As a result，a quadratic polynomial mathematical model was built.The optimal extraction conditions of RSM were determined as follows：Gynostemma pentaphyllum were suspended in microwave power of 400 W，subjected to ultrasonic treatment for 60 min at temperature of 51℃，80% ethanol concentration at solvent-to-solid ratio 28∶1（mL/g）and then microwaves 117 s.The resultofverification experiment（7.05%）was coincided with predictive value.

response surface methodology；microwave-ultrasonic-assisted extraction；Gynostemma pentaphyllum；saponins

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.012

福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA12218）；福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA15310）

尤秀麗（1978—），女（漢），副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的提取、手性識(shí)別機(jī)理研究。

2015-01-19