洛陽地區(qū)常見嗜尸性麗蠅的CO I序列分析

趙琳琳，翟仙敦，張 振，呂 宙，夏志遠，莫耀南

·法醫(yī)學·

洛陽地區(qū)常見嗜尸性麗蠅的CO I序列分析

趙琳琳1，翟仙敦1，張 振1，呂 宙2，夏志遠1，莫耀南1

目的 應(yīng)用多態(tài)性較高的線粒體細胞色素C氧化酶輔酶I(CO I)對洛陽地區(qū)常見麗蠅科嗜尸性蠅類大頭金蠅和絲光綠蠅進行序列分析，以期為嗜尸性蠅類的分子鑒定提供依據(jù)。方法 收集洛陽地區(qū)常見大頭金蠅和絲光綠蠅標本8只，經(jīng)形態(tài)學分類鑒定后，Chelex-100法提取樣本DNA，擴增目的片段后測序，使用相應(yīng)軟件對所得序列分析，建立種內(nèi)及種間進化分歧率，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果 8個樣本擴增獲得CO I的長度為647 bp，CO I種間平均進化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002。結(jié)論 CO I基因可以較好區(qū)分所涉及的蠅種，獲得的基因序列是蠅類基因庫的有益補充。

輔酶I；嗜尸性蠅類；雙翅目麗蠅科；序列分析；法醫(yī)昆蟲學

利用嗜尸性蠅類進行死亡時間推斷，已被法醫(yī)學界廣泛認可[1-2]。尸體上常見的雙翅目(Diptera)蠅類一直是研究的熱點，尤其是麗蠅科[3-7]。成蟲的形態(tài)學鑒定相對容易，卵和幼蟲卻很難區(qū)分，且由于不同地區(qū)生活的嗜尸性蠅類種類有所不同，對于非昆蟲專業(yè)的法醫(yī)工作者來說，嗜尸性蠅類種屬鑒定，始終有一定難度[2,7-8]。分子生物學技術(shù)不斷地發(fā)展，給這一研究領(lǐng)域開辟了很多新途徑。作者選擇多態(tài)性較好的線粒體細胞色素C氧化酶輔酶I(coenzymeⅠ，CO I)基因?qū)β尻柕貐^(qū)常見麗蠅科嗜尸性蠅類大頭金蠅和絲光綠蠅進行序列分析和種屬鑒定，以期為嗜尸性蠅類的分子鑒定基因庫提供有益補充，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 蠅類樣本采集 誘捕采集放置于河南科技大學操場樹林下大鼠尸體上的大頭金蠅和絲光綠蠅各4只。EP管分類單獨密封包裝置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取 取樣本雙前腿，清洗、搗碎，用Chelex-蛋白酶K法提取腿部DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增 采用線粒體CO I基因通用引物，目的片段長度約為700 bp，引物序列[9]見表1。總體系10 μL，內(nèi)含10×PCR緩沖液(含Mg2+的)1 μL，dNTP混合物(2.5 mmol·L-1)1.2 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，5 U·μL-1的TaKaRa Ex Taq?DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板(含10～20 ng DNA)1.2 μL，ddH2O補足體系。PCR循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，共5次循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，共35次循環(huán)；72 ℃ 8 min。

表1 線粒體CO I基因通用引物

1.4 電泳檢測及測序分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，溴化乙錠染色，電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。測序引物為PCR擴增引物，擴增產(chǎn)物由上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，正反鏈雙向測序以保證序列的準確性。應(yīng)用Chromas Version 1.62序列分析軟件將所測8個樣本基因序列進行整理，GenBank中作BLAST進行序列比對搜索，然后用MEGA7.0軟件包按鄰近法(neighbor-joining，NJ)對序列進行堿基組成、進化分歧率和系統(tǒng)發(fā)育樹分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 蠅種基因組提取及測序結(jié)果 本次實驗共獲得麗蠅科金蠅屬大頭金蠅和綠蠅屬絲光綠蠅各4個樣本的DNA，擴增片段核苷酸長度在700 bp左右，經(jīng)過分析軟件去除雜帶和引物后，剩下的核苷酸片段長度為647 bp。BLAST結(jié)果表明實驗樣品與GenBank中已知序列相似度大于99%，與形態(tài)鑒定結(jié)果相符合，見表2。

表2 8 個麗蠅科樣本線粒體CO I基因序列在線BLAST比對結(jié)果

注：Chrysomya：金蠅屬；C. Megacephala：大頭金蠅；L.sericata：絲光綠蠅。

2.2 堿基組成差異分析 對8例蠅類成蟲樣本的CO I基因進行序列分析，結(jié)果顯示：保守位點593個，可變位點54個，其中簡約性信息位點54個，自裔位點0個。堿基平均組成為：A=30.4%，G=15.9%，C=15.3%，T=38.4%，A+T =68.8%，具有明顯的A+T傾向性。

2.3 發(fā)育樹分析 運用MEGA7.0軟件包對上述各種蠅類線粒體CO I基因序列進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果按照不同屬種分別聚類，分子鑒定結(jié)果和形態(tài)學鑒定結(jié)果一致,見圖1。在麗蠅種的級別上，自上而下形成了鮮明的2個群聚，分別包括4只大頭金蠅和4只絲光綠蠅，支持率分別為100%和72%，效果較好；4只絲光綠蠅分聚為2小支，種間劃分清晰。

注：圖中右側(cè)依次顯示為蠅種名稱、樣本編號，左側(cè)分支上的數(shù)字表示群聚的支持率(%)，圖左下方為標尺，表示0.01進化距離的長度。C. Megacephala：大頭金蠅；L.sericata：絲光綠蠅。圖1 基于8 只樣本線粒體CO I基因序列構(gòu)建的NJ發(fā)育樹

2.4 種內(nèi)及種間進化分歧 經(jīng)計算獲得麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅共8個不同個體的遺傳距離，2蠅種平均進化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002，種間差異和種內(nèi)差異沒有交叉，見表3。

表3 8個樣本線粒體CO I基因序列進化分歧表

注：序號1～4：大頭金蠅；序號5～8：絲光綠蠅。

3 討論

只有對嗜尸性蠅類種屬做出準確鑒定，才能根據(jù)該種蠅類的生活特性推斷個體死后間隔時間(postmortem interval,PMI)[11-12]。傳統(tǒng)的嗜尸性蠅類形態(tài)學種屬鑒定要求具有豐富的昆蟲學經(jīng)驗，鑒于案發(fā)現(xiàn)場提取的樣本蠅類多樣性和復雜性，對于非昆蟲專業(yè)人員很難從嗜尸性蠅類形態(tài)學鑒定其種屬。

本次實驗共獲得麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅8個蠅類個體的DNA樣本，擴增并測序后，經(jīng) BLAST在線比對表明實驗樣品與GenBank中相應(yīng)蠅種已知序列相似度大于99%，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致；對上述蠅類mtDNA上CO I基因序列進行分析，在麗蠅種的級別上形成大頭金蠅和絲光綠蠅2個群聚，支持率分別為100%和72%，種間劃分清晰，效果較好；本實驗中2個蠅種平均進化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002，種間差異和種內(nèi)差異沒有交叉。結(jié)果表明，洛陽地區(qū)常見麗蠅科嗜尸性蠅類大頭金蠅和絲光綠蠅的線粒體CO I(647 bp)序列能較好地對大頭金蠅和絲光綠蠅種類進行鑒別，且種內(nèi)差異小。因此，可以根據(jù)mtDNA中CO I基因序列的差異鑒定不同的蒼蠅個體是否同種，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[13-15]。但由于各研究采用了不同的目的基因，即便是相同的基因也分屬于不同的片段，這就對昆蟲學分子鑒定的研究提出了更高的要求，可以考慮建立類似人類遺傳標記的蠅類標準化數(shù)據(jù)庫，便于共享和查詢相關(guān)的數(shù)據(jù)信息。

總之，本研究表明洛陽地區(qū)常見麗蠅科嗜尸性蠅類大頭金蠅和絲光綠蠅的線粒體CO I(647 bp)序列能較好地對大頭金蠅和絲光綠蠅種類進行鑒別，而且種內(nèi)差異小。因此，可以根據(jù)mtDNA中CO I基因序列的差異鑒定不同的蒼蠅個體是否同種，為法醫(yī)學實踐服務(wù)，而且獲得的基因序列也是嗜尸性蠅類基因庫的有效補充。并且，還可與形態(tài)學鑒定互為補充，對死亡時間和死亡現(xiàn)場的推斷分析具有較高的實用價值。

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CO I Sequence Analysis of Common Calliphoridae Necrophagous Flies from Luoyang

ZHAO Lin-lin1, ZHAI Xian-dun1, ZHANG Zhen1, Lv Zhou2, XIA Zhi-yuan1, MO Yao-nan1

(1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.School of criminal investigation, Southwest University of Political Science and Law, Chongqing 400031,China)

ObjectiveTo analyze the common Calliphoridae flies from Luoyang by high polymorphisms of mtDNA CO I gene for identifying the species of necrophagous flies.MethodsEight flies including C. Megacephala and L.sericata were collected and classified by entomologists with traditional morphological characteristics. The DNA of flies was extracted with Chelex-100 method. The fragments of CO I were amplified and sequenced. All the sequences were analyzed by related software packages for nucleotide composition, genetic distance computation and phylogenetic tree construction.ResultsThe result of amplification with 8 samples showed that length of the obtained CO I sequences were 647 bp. The interspecific difference in CO I ranged from 0.114 to 0.117 with an average of 0.116, while the intraspecific difference was 0 to 0.002.ConclusionThe results indicated that congeneric species could be separated by CO I gene, which could be a supplement of necrophagous flie gene pool.

coenzyme Ⅰ；necrophagous flies；Diptera Calliphoridae；sequence analysis；forensic entomology

1672-688X(2016)04-0286-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.015

河南省基礎(chǔ)與前沿課題(112300410082) 河南科技大學基金(09001309，13000914，13000696)

2016-09-26

1.河南科技大學法醫(yī)學院，河南洛陽 471003 2.西南政法大學刑事偵查學院，重慶 400031

趙琳琳(1991-)，女，河南安陽人，從事法醫(yī)物證和法醫(yī)昆蟲學研究。

翟仙敦，女，博士，副教授，E-mail：xiandunzhai@163.com

Q969.453.2;D919.4

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