企鵝珍珠貝Creb2基因的克隆及表達分析

于非非，余祥勇，潘珍妮，宋娜娜，王梅芳

（廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088）

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企鵝珍珠貝Creb2基因的克隆及表達分析

于非非，余祥勇，潘珍妮，宋娜娜，王梅芳

（廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088）

CREB（cAMP response element binding protein）是一種真核生物中廣泛存在的調控因子。為了探討企鵝珍珠貝（Pteria penguin）Creb基因的序列和表達特征，為進一步闡述Creb的生理功能提供科學依據，本研究利用RACE-PCR技術克隆到企鵝珍珠貝一個Creb基因的全長序列，分析其理化性質和進化地位；利用熒光定量PCR分析Creb基因在各組織中的表達特征。結果表明，該企鵝珍珠貝Creb基因的cDNA全長為1484 bp，其中開放閱讀框（ORF）為1071 bp，編碼356個氨基酸，5′非編碼區為218 bp，3′非編碼區為 195 bp，C端包含一個堿性亮氨酸拉鏈結構（basic region leucin zipper，bZIP）。預測其分子質量為39.49 kD，等電點為4.43。序列比對顯示該企鵝珍珠貝Creb基因與歐洲平牡蠣（Ostrea edulis）和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的Creb2同源性（identity）最高，分別為46.3%和46.1%，故命名為ppCreb2；系統進化樹分析結果與傳統形態學分類結果相吻合。熒光定量PCR分析顯示，ppCreb2在企鵝珍珠貝的各個組織中組成性表達，其中在足中表達量最高，鰓中其次。

企鵝珍珠貝；ppCreb2；基因克隆；表達分析；熒光定量PCR

doi：10.11759/hykx20150824001

CREB（cAMP response element binding protein）即環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，是真核生物中廣泛存在的一種細胞核內調控因子，通過自身磷酸化實現轉錄功能的調控［1］。CREB家族蛋白的C端都包含大量堿性氨基酸和一個亮氨酸拉鏈，被稱為堿性亮氨酸拉鏈結構域 （basic region leucin zipper，bZIP）［2］，這一結構域的DNA親和力很高，能以二聚體的形式與靶基因啟動子中的CRE（cAMP response element）位點結合，調控下游多個基因的轉錄活性，是CREB家族蛋白最保守的區域。作為一種重要的轉錄調控因子，CREB家族蛋白參與了細胞的增殖［3］、分化［4］和凋亡［5］，學習記憶［6］，精子發生［7］和膚色決定［8］等多種復雜的生命活動。根據結構和功能的不同，CREB家族被劃分為CREB1、CREB2、CREB3和CREB3L4（CREB3-like4）四個亞族。近年來，已在節肢動物［9］、腔腸動物［10］、魚類［11］、鳥類［12］和哺乳動物［7］等幾十個物種中克隆到Creb基因，但在雙殼類中研究較少［13］。

企鵝珍珠貝（Pteria penguin）屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），翼形亞綱（Ptermorphia），珍珠貝目（Pterioida），珍珠貝科（Pteriidae）［14］。企鵝珍珠貝個體大、生長快、成活率高，其突出特點是分泌珍珠質機能旺盛、珠層厚、色澤奇異，是我國目前唯一能規模養殖的大型珍珠貝，被認為是最具有“振興南珠”潛能的品種［15］。作為一種調控因子的Creb基因是否也存在于企鵝珍珠貝中，是否參與了企鵝珍珠貝重要生命活動的調控是值得探索的問題。

本研究建立了企鵝珍珠貝全組織的轉錄組數據庫，利用RACE-PCR技術克隆到企鵝珍珠貝Creb2基因的cDNA全長序列，構建系統進化樹分析該基因的進化地位；利用熒光定量PCR技術分析Creb2基因在企鵝珍珠貝各組織中的表達差異，旨在為進一步闡述Creb2在企鵝珍珠貝各種生理過程中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用企鵝珍珠貝采自廣東省湛江市雷州市流沙灣養殖群體，體重300～350 g。

1.2 主要試劑

實驗所用主要試劑包括SMARTer?RACE 5′/3′Kit （Clontech）、 UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（上海生工）、 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）、 E.Z.N.A Gel Extraction Kit試劑盒（Omega）、SYBR Select Master Mix（Life technologies）、LA taq（Takara）、PMD18-T（Takara）、瓊脂糖（Agarose）等。DEPC、氨芐青霉素等其他試劑為國產分析純，DH5α感受態細胞購自全式金。

1.3 企鵝珍珠貝Creb全長cDNA的克隆

分別提取企鵝珍珠貝的外套膜、鰓、閉殼肌、消化盲囊、足、精巢、卵巢的RNA，將各組織RNA混合后應用Illumina測序技術進行轉錄組測序，建立了企鵝珍珠貝全組織的轉錄組數據庫，并進行生物信息學分析。

利用企鵝珍珠貝各組織混合 R N A，按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit說明書合成企鵝珍珠貝Creb的3′RACE模板和5′RACE模板。根據企鵝珍珠貝轉錄組數據庫中注釋為Creb的unigene序列設計企鵝珍珠貝Creb基因3′RACE的特異性引物Creb-3-F和5′RACE的特異性引物Creb-5-R（表1），3′RACE和5′RACE PCR反應體系為2×SeqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，5′RACE或3′RACE cDNA模板（100 ng/μL）2.5 μL，10×UPM（Universal Primer Mix，0.2μmol/L）5 μL（表1），Creb-3-F或Creb-5-R（10μmol/L）1 μL，PCR-Grade H2O 15.5 μL。使用touch-down PCR程序擴增：94℃30 s，72℃2 min，5個循環；94℃30 s，70℃30 s，72℃ 2 min，5個循環；94℃30 s，68℃30 s，72℃2 min，25個循環。PCR產物經電泳分離、純化，與RACE試劑盒中的 Lineareized pRACE vector連接，轉化進DH5α感受態細胞中培養過夜，篩選陽性克隆進行測序。經測序后3′RACE序列和5′RACE序列進行拼接，并利用 VecScreen軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）去除載體序列，獲得企鵝珍珠貝Creb基因的電子全長。

根據Creb基因的電子全長，設計特異引物Creb-cDNA-F和Creb-cDNA-R（表1），利用LA taq酶克隆Creb基因全長cDNA。PCR產物與PMD18-T載體連接、轉化、培養，篩選陽性克隆測序以驗證電子全長序列的正確性。

1.4 目的基因的生物信息學分析

通過ORF Finder工具，推導企鵝珍珠貝Creb基因編碼的氨基酸序列；通過 Expasy網站（http：// web.expasy.org/compute_pi/）分析其相對分子質量和等電點；經ProtScale軟件分析氨基酸序列的疏水性；經SignalP 4.1、TMHMM和NetOGlyc 4.0分別預測其信號肽、跨膜結構及糖基化位點；經SMART對其進行結構預測和功能分析；利用Clustal X（1.8）軟件將獲得的企鵝珍珠貝Creb基因與其他物種的Creb基因編碼氨基酸進行同源比對，用MEGA6軟件構建系統進化樹。

1.5 熒光定量PCR檢測目的基因的組織表達

分別提取企鵝珍珠貝外套膜、鰓、閉殼肌、消化盲囊、足、精巢和卵巢的RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，進行熒光定量PCR檢測。以β-actin基因作為內參，以企鵝珍珠貝的閉殼肌為對照，采用2-ΔΔCt法計算Creb基因在不同組織中的表達水平，每組設3個重復，組間重復性和差異顯著性用SPSS16.0分析。

2 結果與分析

2.1 企鵝珍珠貝Creb基因的克隆和序列分析

采用5′RACE技術獲得了1169 bp的Creb 5′序列，采用3′RACE技術獲得了678 bp的Creb 3′序列，拼接后獲得1484 bp的Creb全長序列。利用CrebcDNA-F和Creb-cDNA-R引物進行PCR驗證，獲得1328 bp序列，與我們拼接的Creb基因全長序列相吻合。企鵝珍珠貝Creb基因cDNA全長為1484 bp，其中開放閱讀框（ORF）為1071 bp，編碼356個氨基酸，5′非編碼區為218 bp，3′非編碼區為 195 bp，包含30 bp 的polyA尾巴，如圖1所示。登錄號為KT388104。

圖1 企鵝珍珠貝Creb基因序列分析Fig.1 Creb cDNA and deduced amino acid sequences of Pteria penguin小寫字母代表非編碼序列（UTR）；大寫字母代表開放閱讀框（ORF），灰色框代表堿性亮氨酸拉鏈結構域（276～341 bp）5′UTR and 3′UTR regions are shown in small letters；open reading fragment is shown in capital letters；basic region leucin zipper（bZIP）is shown in gray box（276-341 bp）

2.2 CREB蛋白理化性質預測和分析

經Expasy預測企鵝珍珠貝CREB蛋白分子質量為39.49 kD，等電點為4.43。ProtScale分析疏水性顯示，該蛋白的疏水指數從-3.678至2.2，屬于親水性蛋白，約在第164位表現出最強的疏水性，第298位表現出較出最強的親水性（圖2）。經TMHMM 2.0進行跨膜結構域預測，顯示沒有跨膜區。SignalP4.1預測其不存在信號肽，屬于非分泌型蛋白。NetOGlyc4.0分析發現其有3個糖基化位點，分別是第22位、第26位和第108位。SMART軟件分析發現，企鵝珍珠貝CREB蛋白的N端富含天冬氨酸（Asp，D）和谷氨酸（Glu，E）等酸性氨基酸，C端富含賴氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，R）等堿性氨基酸，包含一個典型的堿性亮氨酸拉鏈結構域（basic region leucin zipper，bZIP）（圖1和圖3）。

圖2 企鵝珍珠貝CREB蛋白的疏水性預測Fig.2 Hydrophobicity prediction of CREB in Pteria penguin“+”代表疏水值，“-”代表親水值+hydrophobicity；-hydrophobicity

圖3 企鵝珍珠貝CREB蛋白質結構預測Fig.3 Prediction of CREB structure in Pteria penguin

2.3 CREB氨基酸序列同源性分析

采用Clustal X軟件將企鵝珍珠貝的Creb基因與其他物種的Creb基因編碼氨基酸進行多序列比對，結果顯示，該基因與歐洲平牡蠣（Ostrea edulis，ADG85255.1）和近江牡蠣（Crassostrea ariakensis，BQ59345.1））的Creb2基因同源性（identity）最高，分別為46.3%和46.1%；與人（Homo sapiens，AAA52071.1）、小鼠（Mus musculus，NP_033846.2）和墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus,XP_007231405.1）的Creb2基因同源性其次，分別為為26.3%、25.7%和24.6%。其中，保守位點主要集中在堿性亮氨酸拉鏈結構域（圖4）。因此將該企鵝珍珠貝Creb基因命名為ppCreb2。

分別選取近江牡蠣、歐洲平牡蠣、光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata，ACZ51334.1）creb、靜水椎實螺（Lymnaea stagnalis，BAC21159.1）、海兔（Aplysia californica，NP_001191630.1）和墨西哥脂鯉等物種的Creb2基因編碼的氨基酸進行聚類分析，如圖 5 Neighbor-joining（NJ）樹所示：企鵝珍珠貝、太平洋牡蠣和歐洲平牡蠣都屬于軟體動物瓣鰓綱，其Creb2編碼氨基酸聚為一個小的進化分支；光滑雙臍螺、靜水椎實螺和海兔屬于軟體動物腹足綱，聚為一個小的進化分支；以上所有的軟體動物聚為一個大的進化分支，而墨西哥脂鯉這一外群物種單獨列為一個進化分支。CREB2聚類結果與傳統的進化分類學相吻合，印證了雙殼類瓣鰓綱和腹足綱動物的親緣關系。

圖4 企鵝珍珠貝與其他物種Creb2基因編碼氨基酸比對Fig.4 Amino acid alignment of Creb2 in Pteria penguin and other homologues相同的氨基酸以涂黑表示The amino acids showing100%identity are marked with black box

圖5 企鵝珍珠貝與其他物種Creb2氨基酸序列的系統進化樹（NJ）Fig.5 Phylogenetic tree of Creb2 from Pteria penguin and other homologues

2.4 Creb2基因的組織定量分析

采用熒光定量PCR分析Creb2基因在企鵝珍珠貝各個組織中的表達水平，結果顯示（圖6），從RNA水平看，ppCreb2基因在企鵝珍珠貝各個組織中都有表達，但表達量有所差異。在足中表達量最高，其次是鰓，在外套膜、閉殼肌、精巢和卵巢中的表達量較低。

圖6 ppCreb基因在企鵝珍珠貝各組織的表達水平Fig.6 Expression of ppCreb in different tissues of Pteria penguinM.外套膜；G.鰓；AM.閉殼肌；DD.消化盲囊；F.足；T.精巢；O.卵巢M：mantle；G：gill；AM：adductormuscle；DD：digestive diverticulum；F：foot；T：testis；O：ovary

3 討論

1986年，Montrminy等［1］發現許多基因都受cAMP的調控，這些基因的共同特點是啟動子和增強子序列中含有一段高度保守的5′-TGACGTCA-3′序列，并命名為cAMP反應元件（cAMP response element，CRE）。隨后，他們又分離純化到一種特異性結合CRE的核蛋白，命名為cAMP應答元件結合蛋白（cAMP response element binding protein）即CREB蛋白［16］。CREB蛋白家族主要包括CREB1、CREB2、CREB3和CREB3L4四個成員。CREB2（cyclic AMP response element binding protein 2），也稱ATF4（activating transcription factor 4），是內質網應激通路中的信號轉導蛋白，由PERK/elF2α通路中磷酸化的elF2α激活［17］。

本研究從企鵝珍珠貝cDNA文庫中克隆了Creb基因全長序列。同源性分析顯示，企鵝珍珠貝Creb基因與歐洲平牡蠣Creb2基因具有最高的同源性，為46.3%。結構分析發現，企鵝珍珠貝Creb基因編碼氨基酸分為N端和C端兩個結構域，其N端富含酸性氨基酸，為酸性激活區域；C端為保守的堿性亮氨酸結構域。不含KID區（激酶誘導結構域），為非跨膜蛋白，這些特點與大多數動物經典的CREB2蛋白結構相似［18-19］。其中N端主要行使轉錄激活功能，C端主要行使DNA結合和蛋白二聚體化的功能。因此，我們將該企鵝珍珠貝Creb基因鑒定為ppCreb2。這說明Creb2基因在各個物種中是相對保守的，也暗示了ppCreb2基因在貝類的生命活動中起到重要作用。

作為一種重要的轉錄因子，CREB2參與了多種生命過程。對海兔和果蠅的研究發現，CREB2可抑制記憶貯存和突出可塑性，是一種記憶抑制基因［20-21］。CREB2參與了小鼠造骨細胞早期分化和末期分化，對維持造骨細胞的分化和功能至關重要，CREB2缺陷小鼠出現小眼癥狀表型［4］。CREB2也可參與內質網應激反應（endoplasmic reticulum stress），調節內質網內穩態體系［22］。還可與多種病毒蛋白相互作用，調節與之結合的病毒蛋白的表達水平［23］。

與CREB2廣泛的生理功能相一致的，Creb2在各個組織中普遍表達。對豬的研究發現，Creb2在白色脂肪組織、胃、腎肺、小腦、肝臟和淋巴組織中表達量較高，在心臟和肌肉中表達量較低［24］。我們的研究發現，ppCreb2基因在企鵝珍珠貝足中表達量最高，這可能與Creb2在神經系統中大量表達相一致［20］。作為進化地位比較低的軟體動物，其神經系統主要由4對神經節和與之聯絡的神經構成，其中重要的一對神經節足神經節1就位于足的前部［25］。另外，ppCreb2基因在鰓中表達量也很高。貝類通過鰓直接與水環境接觸，營呼吸功能，接觸大量病毒和細菌，在鰓中大量表達印證了CREB2蛋白可與多種病毒蛋白相互作用這一功能。因此，我們推測CREB2在企鵝珍珠貝多種生命活動中起到重要作用。

［1］ Montrminy M R，Sevarino K A，Wag-ner J A，et al.Identification of a cyclic-AMP responsive element within the rat somatostatin gene［J］.Proceedings of the Natural Academic of Science of the United Stated America，1986，83（18）：6682-6686.

［2］ Shanware N P，ZhanL，HutchinsonJ A，etal.Conserved and distince modes of CREB/ATF transcription factor regulation by PP2A/B56 gamma and genotoxic stress［J］.Plos One，2010，5（8）：e12173.

［3］ Garcia，G E，Nicole A，Bhasharan S，et al.Akt and CREB-mediated prostate cancer cell proliferation inhibition by Nexrutine，a Phellodendron amurense extract［J］.Neoplasia，2006，8（6）：523-533.

［4］ Yang X， Karsenty G. ATR4， the osteoblast accumulation of which is determined post-translationally，can induce osteoblast-specific gene expression in non-osteoblastic cells［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（45）：47109-47114.

［5］ Persengiev S P，Devireddy L R，Green M R.Inhibition of apoptosis by ATFx：a novel role for a member of the ATF/CREB familiy of mammalian bZIP transcription factors［J］.Genes&Development，2002，16（14）：1806-1814.

［6］ Kida S，Serita T.Functional roles of CREB as a positive regulator in the formation and enhancement of memory［J］.Brain Research Bulletin，2014，105：17-24.

［7］ Gomez M， Manzano A， Figueras A， et al.Sertoli-secreted FGF-2 induces PFKFB4 isozyme expression in mouse spermatogenic cells by activation of the MEK/ERK/CREB pathway［J］.American journal of Physiology Endocrinology and Metabolism，2012，303（6）：E695-707.

［8］ Wan P，Hu Y Q，Li H.Regulation of melanocyte pivotal transcription factor MITF by some other transcription factors［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2011，354（1-2）：241-246.

［9］ Lijima K，Zhao L，Shenton C，et al.Regulation of energy stores and feeding by neuronal and peripheral CREB activity in Drosophila［J］.PLoS One，2009，4（12）：e8498.

［10］Kaloulis K，Chera S，Hassel M，et al.Reactivation of developmental programs： the cAMP-reponse element-binding protein pathway is involved in hydra head regeneration ［J］.Proceedings ofthe Natural Academic of Science of the United Stated America，2004，101（8）：2363-2368.

［11］Rajan K E，Thangaleela S，Balasundaram C.Spatial learning associated with stimulus response in goldfish Carassius auratus：relationship to activation of CREB signalling［J］.Fish Physiology and Biochemistry，2015，41（3）：685-694.

［12］Guo F，ZhangY，SuL，etal.Breed-dependent transcriptional regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase，cytosolic form，expression in the liver of broiler chickens［J］.Poultry Science，2013，92（10）：2737-2744.

［13］Zhang S M，Coultas K A.Identification and characterization of five transcription factors that are associated with evolutionarily conserved immune signaling pathway s in the schistosome-transmitting snail Biomphalaria glavrata［J］.Molecular Immunology，2011，48（15-16）：1868-1881.

［14］蔡英亞，張英，魏若飛.貝類學概論［M］.上海：上海科學技術出版社，1995：209-210.

Cai Yingya，Zhang Ying，Wei Ruofei.Malacology［M］.Shanghai：Shanghai Science and Technology Press，1995：209-210.

［15］毛勇，梁飛龍，余祥勇，等.企鵝珍珠貝游離珠插核效果的初步觀察［J］.海洋科學，2003，27（11）：1-4.

Mao Yong，Liang Feilong，Yu Xiangyong，etal.Preliminary observations on implanation efficiency of cultured round pearls with pearl oyster，Pteria （Magnavicula）penguin roding［J］.Marine Sciences，2003，27（11）：1-4.

［16］Montrminy M R，Bilezikjan L M.Binding of a nuclear protein to the cycli c-AMP response element of the somatost atin gene［J］.Nature，1987，328（6126）：175-178.

［17］Ameri K，Harris A L.Activating transcription factor 4［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（1）：14-21.

［18］Qi M，Lei T，Zhou L，et al.Cloning，characterization，chromosomal mapping and tissue transcription analysis of porcine CREB2 and CREB3 genes［J］.Folia Biologica，2009，55（4）：137-144.

［19］Endo M，Su L，Nielsen T O.Activating transcription factor 2 in mesenchymal tumors［J］.Human Pathology，2014，45（2）：276-284.

［20］Mohamed，H A，Yao W，Fioravante D，et al.cAMP-response elements in Aplysia crebl，creb2，and Ap-uch promoters：implications for feedback long term memory［J］.The Journal of Biological Chemistry，2005，280（29）：27035-27043.

［21］Dubnau J，Tully T.Gene discovery in Drosophila：new insights for learning and memory［J］.Annual review of Neuroscience，1998，21：407-444.

［22］Lu P D，Harding H P，Ron D.Translation reinitiation at alternative open reading frames regulates gene expression in an integrated stress response［J］.The Journal of Cell Biology，2004，167（1）：27-33.

［23］Lim C，Sohn H，Gwack Y，et al.Latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（human herpesvirus-8）binds ATF4/CREB2 and inhibits its transcriptional activation activity［J］.The Journal of General Virology，2000，81（pt11）：2645-2652.

［24］祁艷梅.豬CREB家族基因的克隆及表達研究的初步探討［D］.武漢：華中農業大學，2009.

QiYanmei.Cloning and preliminary research of porcine CREBs family［D］. Wuhan： HuaZhong Agricultural University，2009.

［25］李霞.水產動物組織胚胎學［M］.北京：中國農業出版社，2005：82-83.

LiXia.AquaticAnimalEmbryology［M］.Beijing：China Agriculture Press，2005：82-83.

（本文編輯：康亦兼）

Molecular cloning and expression analysis of Creb2 gene from Pteria penguin

YU Fei-fei,YU Xiang-yong,PAN Zhen-ni,SONG Na-na,WANG Mei-fang

（Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Aug.22，2015

Pteria penguin；ppCreb2；Gene cloning；expression analysis；real-time PCR

In this study，in order to analyze the sequence and expression characteristics of the cAMP response element binding protein（Creb）gene in the Pteria penguin，we characterized the full-length cDNA of the Creb gene from the Pteria penguin by the rapid amplification of cDNA ends（RACE）-polymerase chain reaction（PCR）.We then used real-time PCR to examine the expression of Creb in different tissues.The results show that the full-length cDNA of Creb was 1484 bp，including a 5＇UTR of 218 bp，a 3＇UTR of 195 bp，and an open-reading frame of 1071 bp，which encodes a deduced protein of 356 amino acids.The C-terminal region contained a conserved basic region leucin zipper（bZIP）.The predicted molecular weight was 39.49 kD，and the isoelectric point was 4.43.The sequence comparison showed that Creb in the Pteria penguin（ppCreb2）shares 46.3%and 46.1%sequence identities with Creb2 in Ostrea edulis and Crassostrea gigas，respectively.The phylogenetic analysis results were consistent with traditional taxonomic analysis.The real-time PCR showed that ppCreb2 was constitutively expressed in all studied tissues（mantle，gill，adductor muscle，digestive diverticulum，foot，testis，and ovary），with higher levels in the foot and gill.

Q341

A

1000-3096（2016）05-0029-07

2015-08-22；

2015-10-20

廣東海洋大學優秀青年骨干教師培養項目（20140040）；廣東海洋大學博士啟動基金（E15041）；廣東省海洋漁業科技推廣專項項目（A201308A11）

［Foundation：the Outstanding Young Teacher Foundation of Guangdong Ocean University，No.20140040；Doctoral research project of Guangdong Ocean University，No.E15041；the Technology Extension Foundation of Marine Fishery in Guangdong Province，No.A201308A11］

于非非（1980-），女，山東威海人，講師，博士，從事貝類分子遺傳育種的研究，電話：0759-2383504，E-mail：yufeifei2000@163.com；王梅芳，通信作者，教授，E-mail：pearlang@126.com