南極低溫降解菌Shewanella sp.NJ49羥化酶分離純化及最適產酶條件研究

劉芳明，王以斌，曲長鳳，梁 強，鄭 洲，繆錦來，肖 天

（1.中國科學院 海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國科學院大學，北京100049；3.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061）

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南極低溫降解菌Shewanella sp.NJ49羥化酶分離純化及最適產酶條件研究

劉芳明1，2，3，王以斌3，曲長鳳3，梁 強3，鄭 洲3，繆錦來3，肖 天1

（1.中國科學院 海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國科學院大學，北京100049；3.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061）

羥化酶是細菌降解烷烴的關鍵酶，本文以南極低溫降解菌Shewanellasp.NJ49為研究對象，通過硫酸銨沉淀、超濾濃縮及葡聚糖凝膠Sephadex G-75柱層析方法，分離純化NJ49的羥化酶，獲得了單一羥化酶組分，研究了溫度、pH、表面活性劑和鹽度等環境因素對NJ49羥化酶酶活活性影響。結果表明，羥化酶組分由α、β、γ三個亞基組成，分子質量分別為56，45和36 kD。NJ49最適產酶條件為：溫度15℃、pH7.2、鹽度55；不同類型表面活性劑對酶的活性影響效應不一，兩性離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑對酶活沒有作用，陰離子表面活性劑+非離子表面活性劑混和劑和陽離子表面活性劑+非離子表面活性劑混和劑能提高羥化酶的活性。

Shewanella；羥化酶；分離純化；環境因素

doi：10.11759/hykx20151031001

烷烴的生物降解過程中，第一步反應通常是烷烴在加氧酶的作用下轉化為相應的醇，這是一個關鍵步驟，很大程度上決定了烷烴的降解速率和降解范圍。羥化酶是加氧酶的一種，細菌的降解過程一般由烷烴羥化酶基因（alkB）及其同源體編碼的烷烴羥化酶啟動［1］，研究羥化酶的組成、結構和基因信息有助于了解細菌的代謝機制。

當前對烷烴降解菌的研究以菌株篩選、羥化酶基因克隆為主，劉曄等［2-3］發現3株能夠高效降解C20到C33長鏈烷烴的細菌，并分離確定了Pseudomonas aeruginosa1785和P.marginata766的烴羥化酶基因（alkB）片段，邵宗澤等［4-6］從不同地點的海水中篩選了大量烴降解菌，并對烷烴降解菌的分子生物學特征進行了較深入的研究，2008年從一株來自表層海水的石油降解菌中克隆到大小為426 bp的烷烴羥化酶基因（alkB）片段和843 bp的P450烷烴羥化酶基因的部分序列，2009年在一株能夠降解C10-C36直鏈烷烴的菌株中，發現至少編碼兩套與烷烴降解相關的單加氧酶系統（AlkB和CYP153羥化酶）；同年在印度洋深層海水中篩選到一株具有強柴油降解能力的革蘭氏陰性菌P40，并從中克隆到兩個烷烴羥化酶alkB基因片斷。余瑛等［7］篩選到9株細菌均能分解利用潤滑油，其alkB基因擴增片段大小介于160 bp和400 bp之間；孫敏等從菌株Acinetobacter sp.W3的基因組DNA和質粒DNA上分別獲得了大小為540 bp的烷烴羥化酶基因alkB和864 bp的CYP153A烷烴羥化酶基因DNA片段［8］。已有的研究報道針對羥化酶基因水平的研究較多，且多關注常溫細菌的羥化酶， 對羥化酶蛋白屬性尤其是低溫菌的羥化酶研究欠缺。低溫菌在低溫海洋環境（南北極海域、我國北方海域、深海）溢油污染物清除中具有很大修復潛力，南極Shewanella sp.NJ49是本實驗室前期篩選的低溫降解菌，我們對NJ49的羥化酶進行了定域，并對酶代謝進行了初步研究［9］，結果表明NJ49的羥化酶位于胞外，本文將報道羥化酶純化和最佳產酶條件，以期為南極低溫降解菌的實際修復應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用細菌為南極低溫降解菌Shewanella sp.NJ49，為2001年11月至2002年3月中國第十八次南極科學考察期間采集的海冰樣品中篩選分離所得。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養

超凈工作臺里挑取NJ49單菌落，加入含有2216E培養基（蛋白胨5 g，酵母1 g，經過濾的海水1 L，pH7.6，121℃濕熱滅菌20 min）的錐形瓶，同時加入經0.45 μm濾膜過濾的正十六烷烴，在15℃下，以120 r/min恒溫振蕩大量培養，培養3 d。

1.2.2 酶的分離和純化

取活化好的菌液5 mL，轉入100 mL的MMC培養基（MMC人工海水培養基為A、B液121℃濕熱滅菌20 min，混勻并補加適量微量元素混合液形成。A液組分：NaCl 24 g/L，MgSO4·7H2O 7 g/L，NH4NO41 g/L，KCl 0.7 g/L；B液組分KH2PO42 g/L，Na2HPO43 g/L，海水1 L，pH 7.4），在15℃下，以120 r/min恒溫振蕩大量培養，培養7 d，參照文獻［10］用靜息細胞技術分步大量提取胞外酶（約10 L）。

1.2.2.1 硫酸銨鹽析

將裝有上清液（9.8 L）的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內，并置于磁力攪拌器上攪拌；緩慢加入研細的固體硫酸銨，使其飽和度達到70%，置于4℃過夜，將鹽析后的溶液12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，將沉淀溶于50 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）緩沖液中。4℃，12 000 r/min離心15 min，棄去沒有溶解的沉淀，上清液即為硫酸銨沉淀純化的酶。

1.2.2.2 酶的透析與超濾

將鹽析所得上清液溶液裝入打結的透析袋中，透析袋放入10倍于該溶液體積的50 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）緩沖液中，4℃透析24 h；透析袋規格為MD44（8000～14 000），直徑28 mm。將透析后的液體經分子質量為30～100 kD的超濾膜超濾濃縮。

1.2.2.3 酶活性跟蹤與測定

按文獻［11］中的方法繪制標準曲線。取透析后的溶液1mL置10 mL刻度試管中，依次加入磷酸緩沖液（pH=7.0）、0.1 mol/L葡萄糖溶液和0.4%TTC溶液各2 mL，在37℃下暗保溫1～2 h，待顯色充分后立即加入適量1 mol/L硫酸以停止反應，加乙酸乙酯3～4 mL常溫萃取以提出TTF；同時設置不加酶液的空白對照，于485 nm下測定吸光值（OD485nm），查標準曲線，可求出TTC還原量；在上述條件下，將1 h產生1μg TTF的量定義為1個酶活力單位。

1.2.2.4 Sephadex G-75柱層析

將葡聚糖凝膠Sephardex G-75充分溶脹并抽氣后，裝柱（100 cm×2.0 cm），用0.0175 mol/L磷酸鹽緩沖鹽溶液（pH=6.7）充分平衡，加入上一步純化的樣品，加樣量為3 mL，緩沖液流速為10 mL/h，收集量為3 mL/管。測定每管收集液在280 nm下的光吸收值A280［12］。

以上操作均在4℃環境下進行。

1.2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

純化酶分子質量的采用SDS變性凝膠電泳［13］。分離膠為12.5%的丙烯酰胺，濃縮膠為5%的丙烯酰胺，恒流先以4 mA電泳、進入分離膠后再以10 mA電泳，完成后剝離膠用考馬斯亮藍R-250或銀染法進行染色。考染法為：20%三氯醋酸固定1 h；以含0.1%R-250、40%無水乙醇、10%冰醋酸的染液，染色2 h；以含40%無水乙醇、10%冰醋酸的洗脫液，脫色1 h，中間換一次洗脫液；最后用去離子水清洗30 min。對電泳結果進行凝膠掃描拍照。

1.2.3 培養條件的優化

1.2.3.1 最適培養溫度測定

設置0、10、15、20、25和30℃的溫度梯度，將NJ49置于pH為7.2的MMC液體培養基中120 r/min培養7d，取樣測定酶活力，得出酶的最適溫度［13］，分別于250 nm和540 nm測定吸光值，計算降解率。

1.2.3.2 最適pH測定

用緩沖液調節MMC液體培養基pH值分別為4、5、6、7、8、9和10，接種NJ49，于15℃，120 r/min培養7d，取樣測定在不同pH值下酶的活性，得出酶的最適pH；反應體系中所用緩沖液：乙酸鈉緩沖液（pH值3.0～5.0）；磷酸緩沖液（pH值6.0～7.0）；Tris-HCl緩沖液（pH值7.0～9.0）；碳酸鈉緩沖液（pH值9.5～11.0）。降解率計算同1.2.3.1。

1.2.3.3 最適鹽度測定

南極低溫降解菌NJ49依次接種于鹽度分別為30、35、40、45、55、65和75的MMC液體培養基中，15℃，pH 7.2，120 r/min培養7d，取樣測定不同鹽度下酶的活性。

1.2.3.4 表面活性劑對酶活性的影響

選取陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑，研究其對NJ49產酶活性的影響。在MMC液體培養基中分別加入100 mg/L十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、卵磷脂、季銨化物、脂肪酸甘油酯（FG）、SDBS+FG和季銨化物+FG，分別接種南極低溫降解菌NJ49，于15℃，pH 7.2，鹽度55，120 r/min培養7 d，取樣測定不同表面活性劑下酶的活性。

2 結果

2.1 酶活檢測結果

根據在485 nm波長下測定的吸光度值繪制TTF標準曲線，如圖1所示。其標準曲線相關性方程為y=0.0037x+0.1314，R2=0.9987，吸光值與TTF濃度呈良好的線性相關。經計算，MMC培養基中羥化酶的活力為62 mg/（L·h）。

圖1 TTF標準曲線Fig.1 Standard curve of TTF

2.2 Sephadex G-75凝膠過濾

將經透析后的酶液經分子質量為30～100 kD的超濾膜超濾濃縮后上樣于Sephadex G-75凝膠過濾柱，過濾分離的結果如圖2所示，凝膠過濾后蛋白質測定為3個峰，分別在6～9管、12～17管出現，第17管后收集的超濾濃縮后樣品在280 nm下的光吸收值均很小，無峰值出現，可知有活性的目的酶應在第6～9管和12～17管收集的樣品中。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-PAGE分析結果見圖3。電泳結果顯示雜帶較多，粗酶液中含有大量的雜蛋白質（圖3泳道1）；純化后的蛋白條帶相比粗酶條帶較弱（圖3泳道2），但仍然清晰地顯示出純化后的羥化酶由三個亞基組成，分子質量分別為56，45和36 kD，表明經層析柱分離純化后得到了含量低但純度高的單一酶。

圖2 Sephadex G-75凝膠過濾結果Fig.2 Elution profile of gel filtration on Sephadex G-75

圖3 羥化酶各步驟純化產物SDS-PAGE電泳結果Fig.3 Protein profile of purification step on 12.5% SDS-PAGEM.蛋白標準分子質量；1.粗酶；2.Sephadex G-75M.protein molecular weight marker：1.Enzyme；2.Sephadex G-75

2.4 培養條件對酶活的影響

2.4.1 培養溫度對酶活性影響

培養溫度對酶活性的影響結果如圖4所示，經分離純化后所得酶在0～15℃區間內，酶活性隨溫度升高而相應增加，15℃時酶活性最高，表明其最適溫度為15℃，之后酶活開始下降，超過25℃時已完全去活性，熱穩定性相對較差。

圖4 酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of the enzyme

2.4.2 最適pH

在中性（pH=7左右）環境條件下，羥化酶活性最高，如圖5所示，強酸或者強堿的環境均能使羥化酶喪失活性，證明該羥化酶是一種中性蛋白酶，酶的最適pH為7.2。

圖5 酶的最適pHFig.5 Optimum pH of the enzyme

2.4.3 鹽度對酶活性影響

菌株NJ49細胞分泌的羥化酶在鹽濃度為30～60區間內均能保持較高的酶活性（圖6），在鹽度55時其酶活性達到最高，當鹽度超過70時，其酶活性迅速下降。

圖6 酶的最適鹽度Fig.6 Optimum salinty of the enzyme

2.4.4 表面活性劑對酶活的影響

如圖7結果所示，不同的表面活性劑單獨使用和混和使用，對羥化酶活性均有積極的促進作用，其中，以陰離子表面活性劑SDBS+非離子表面活性劑FG混和對酶活性提高效果最佳。

3 結論與討論

圖7 表面活性劑對酶活性的影響Fig.7 Effect of surfactant on the enzymeSDBS：十二烷基苯磺酸鈉，FG：脂肪酸甘油酯SDBS：Sodium dodecyl benzene sulfonate，FG：fatty glyceride

希瓦氏屬（Shewanella）細菌因其可以使用多種多樣的電子受體而廣為人知，該屬細菌通常都能利用一些金屬作為電子受體，有些菌株還能還原硝基芳香化合物。電子受體還包括硝酸及亞硝酸、元素硫、延胡索酸等，多樣化的代謝能力不僅顯示了其在地球碳循環中的作用，也賦予了希瓦氏菌在環境生物修復（包括放射性核素污染的環境）和微生物燃料電池方面的巨大應用潛力［14］，國內篩選的具有降解功能的希瓦氏菌包括：可降解甲基對硫磷的Shewanella sp.L-10［15］，可以利用甲苯、苯胺作為電子受體的Shewanella cinica D14T［16］和Shewanella sp.J5［17］、可降解十六烷的Shewanella sp.H-1［18］、可利用甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚作為電子受體的Shewanella sp.CICC 21940、咪唑乙煙酸高效降解菌Shewanella hafniensis P14［19］，說明了希瓦殺菌的降解多樣性。Shewanella sp.NJ49是一株可在低溫環境中降解碳氫化合物的希瓦氏菌，我們前期的研究已表明其有廣泛的降解底物，可以降解C9～C14和C22～C26范圍的長鏈烷烴以及萘、菲等芳香烴，其在15℃條件下對柴油降解率可達68%，遠高于海洋假單胞菌Y4（16%±2.1%）和Y7（24%±2.6%）的降解率［20］，NJ49 在10℃條件下對于萘的降解率為43.5%，高于施氏假單胞菌YC-YH1的33.8%［21］，這充分顯示了NJ49在低溫環境中對烷烴和芳香烴的修復潛力，未來可制做成商品菌，用于低溫海域溢油污染物的清除。

烷烴好氧降解的起始酶統稱為烷烴羥化酶，該類酶是烴代謝途徑的關鍵酶之一，目前鑒定的羥化酶包括了有整合膜的單加氧酶、細菌細胞色素P450（Ⅰ型和Ⅱ型）、雙加氧酶等［22］。有關常溫烷烴羥化酶的結構特征、催化活性等研究較多，對低溫微生物的產生羥化酶報道較少。本文分離純化了低溫降解菌NJ49的羥化酶，獲得了三個亞基（α、β和γ）的組分，分子質量分別為56 kD，45 kD和36 kD。已報道的三株常溫菌 Methylomonas sp.GYJ3［23］、Methylococcus Capsulatus IMV 3021［24］和Methylosinus trichosporium IMV3011［25］的甲烷加氧酶羥基化酶也是由三個亞基組成，GYJ3羥化酶亞基分子質量分別為56、43和27 kD，IMV 3021羥化酶三個亞基分子質量分別為56、43 和23 kD，IMV3011分子質量分別為58、36和23 kD。從三個亞基分子質量大小看，低溫菌與常溫菌羥化酶非常近似，本文測定了NJ49羥化酶在15℃時仍保持較高活性，顯示了酶的低溫特性。低溫能限制微生物的酶活性和酶的分泌水平，微生物能在低溫環境下生存，主要是由于其酶能從生理代謝和生化特征兩方面發揮作用。NJ49羥化酶的亞基數量和分子量和一些常溫菌相似，酶的亞基空間結構、折疊方式和柔性特征等是否相同，有待進一步探究。

南極海洋生態系統的環境特征是低溫、高鹽、強輻射，特殊環境造就了南極降解菌NJ49特殊的代謝機制，使其在低溫高鹽條件下，仍能分泌較高活性的羥化酶。pH值是影響微生物生命活動的重要因素之一，其不但能夠引起細胞膜電荷的變化和微生物對營養物質的吸收，而且還能影響代謝過程中酶的活性。本文設定了不同的溫度、pH、鹽度梯度研究了理化因子對南極降解菌NJ49羥化酶活性的影響，確立了酶的最適條件為溫度15℃、pH7.2、鹽度55，有研究報道，Pseudomonas sp.L-1甜菜堿羥化酶最佳溫度為30℃［26］，中度嗜鹽菌Martelella sp.AD-3中水楊酸-5-羥化酶催化水楊酸降解時的最適溫度、pH和鹽度分別為30℃、7.5和30［27］，與這些菌株的羥化酶相比，NJ49菌株羥化酶在低溫高鹽環境的污染修復中能發揮更大優勢。

表面活性劑可以增加疏水性物質在水相中的溶解度，增加其生物可利用性，提高油脂降解速率。單一的表面活性劑其增溶能力有限，濃度過高又會抑制微生物活性且易造成表面活性劑污染［28］。有研究認為，不同類型表面活性劑混合使用可以有效解決這一問題，如陰離子表面活性劑中混入非離子表面活性劑能有效降低表面活性劑的臨界膠束濃度和提高膠束分子的大小［29］。本研究顯示，表面活性劑的添加能夠不同程度地提高酶活，復合的表面活性劑提高活性的能力要優于單一活性劑，這一發現為該菌在低溫海洋環境的石油污染生物修復提供了理論參考，未來開發商用降解菌制劑時，可輔以不同的表面活性劑促進羥化酶的活性，或者與天然產表面活性劑的菌株復配，提高菌制劑在低溫環境中對溢油污染物的代謝清除能力。

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（本文編輯：康亦兼）

Separation and purification of hydroxylase from Antarctic psychrophilic bacterium Shewanella sp.NJ49 and optimum conditions for its enzyme production

LIU Fang-ming1,2,3,WANG Yi-bin3,QU Chang-feng3,LIANG Qiang3, ZHENG Zhou3,MIAO Jin-lai3,XIAO Tian1

（1.Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China）

Oct.31，2015

Shewanella；hydroxylase；separation and purification；environmental factors

Hydroxylase is a key enzyme with respect to bacteria during hydrocarbon degradation.In this paper，we investigate the Antarctic psychrophilic bacterium Shewanella sp.NJ49.To obtain a single component of hydroxylase，we separated and purified hydroxylase from NJ49 in a series of steps，i.e.，ammonium sulfate precipitation，ultrafiltration concentration，and column chromatography with Sephadex G-75 as the column media.In addition，we studied the relationships between the activity of NJ49 hydroxylase and environmental factors such as temperature，pH，surfactant，and salinity.We found that purified hydroxylase comprised subunits α，β，and γ，with estimated molecular masses of 56，45，and 36 kD，respectively.The optimum conditions for producing NJ49 hydroxylase were a temperature of 15℃，a pH of 7.2，and a salinity of 55‰.Different types of surfactants had different effects on enzyme activity.Although individual amphoteric，cationic，and nonionic surfactants did not inhibit enzyme activity，a mixture of anionic and nonionic surfactants，as well as a mixture of cationic and nonionic surfactants，improved the activity of the hydroxylase.

Q936

A

1000-3096（2016）05-0001-08

2015-10-31；

2015-12-05

國家自然科學基金項目（31200097；41576187）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2013G33；2015G10）；國家自然科學基金-山東省聯合資助開發項目（U1406402-5）

［Foundation：National Science Foundation of China，No.31200097，No.41576187；Basic science and technology research funds projects of central level Public Scientific Research Institute，2013G33，2015G10；The Joint Funds of the National Natural Science Foundation of China and Shandong Province，U1406402-5］

劉芳明（1978-），男，山東乳山人，助理研究員，博士研究生，主要從事環境污染及生態修復研究。電話：0532-88961195，E-mail：liufangming@fio.org.cn；肖天，通信作者，電話：0532-82898586，E-mail：txiao@qdio.ac.cn