表面活性劑耦合離子液體對稻稈酶解糖化的影響

張耿崚，陳細妹，韓業鉅，王小琴，李韻瑩，文　章，邱曉盛

（廣東工業大學環境科學與工程學院和環境健康與污染控制研究院，廣東 廣州 510006）

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表面活性劑耦合離子液體對稻稈酶解糖化的影響

張耿崚，陳細妹，韓業鉅，王小琴，李韻瑩，文章，邱曉盛

（廣東工業大學環境科學與工程學院和環境健康與污染控制研究院，廣東 廣州 510006）

酶解糖化是木質纖維素材料制備生物質乙醇的關鍵環節，因此提高稻稈等木質纖維素材料的酶解糖化效率具有重要意義。以稻稈為原料，采用表面活性劑耦合離子液體為預處理方法，考察預處理溫度、時間、表面活性劑的添加比例對稻稈酶解的影響。結果表明，預處理溫度為110℃、時間為60 min、表面活性劑添加比例為1%，稻稈的酶解效果最佳，與單獨離子液體處理的稻稈相比，纖維轉化率可提高8%～15%。同時分別通過稻稈成分分析、FTIR、XRD、SEM等對預處理前后的稻稈結構進行表征，證實預處理后酶解效率提高的合理性。

表面活性劑；離子液體； 稻稈；酶解

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151450

近幾年，離子液體因具有優良溶解性、強極性、不揮發、不氧化、對水和空氣穩定等特點，作為綠色溶劑具有巨大的潛力，而且關于離子液體的研究和開發十分活躍，已滲透到分析化學、有機化學、物理化學、燃料電池、功能材料以及生命科學、環境工程、能源等諸多領域［5-6］。離子液體作為纖維素溶劑，不僅有效克服了傳統溶劑的缺陷，而且大大拓展了纖維素工業的應用前景，將纖維素工業應用提升到一個更高的平臺。

2002年，Swatloski等［7］首先發現纖維素可以在離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯（［BMIM］Cl）中溶解，這一發現使纖維素的研究進入了一個新階段。此后的研究還表明，離子液體也可以溶解一部分半纖維素［8］、木質素［9］、殼聚糖［10］和蛋白質［11］等成分，有效提高纖維素的酶解產率［12］。然而離子液體處理纖維素材料后在洗滌過程中，會導致纖維素重結晶，從而影響纖維素酶解效率。而表面活性劑可以降低離子液體的張力，有利于處理過程中離子液體與底物更充分接觸，增加離子液體溶解能力，提高酶解效率。目前關于表面活性劑耦合離子液體預處理木質纖維素材料仍鮮有報道［13-14］。本文用表面活性劑耦合離子液體作為預處理，研究不同處理條件對稻稈的酶解效果的影響，并通過預處理前后的稻稈的成分、FTIR、XRD、SEM等，為此預處理技術的應用提供有力的數據支撐。

1　實驗部分

1.1木質纖維素樣品的采集

本次實驗的木質纖維素原料為稻草秸稈。稻草秸稈樣品是生長期為5個月的日本稻米，這些樣品采收于臺灣省臺北市中央研究院的實驗農場（北緯25°020′32.79″，西經121°360′47.40″，海拔高度為18 m）。稻草秸稈收集之后進行風干處理，研磨成粉即為本次實驗的樣品。將稻草秸稈儲存在密封的塑料袋中，于干燥處室溫保存。用網篩對稻草秸稈進行篩分，得到實驗稻草秸稈粉末的粒徑范圍及其含量分別為：粒徑大于300 mm的占3.39%；粒徑為300～150 mm的占47.95%；粒徑為150～106 mm的占15.52%；粒徑為106～75 mm的占20.57%；粒徑小于75 mm的占2.63%。

1.2實驗藥品與儀器

氯化-1-丁基-3-甲基咪唑（上海成捷化學有限公司），99%；十二烷基硫酸鈉（SDS）（上海泰坦科技股份有限公司），＞65%；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（Sigma-Aldrich），＞98%；3，5-二硝基水楊酸（成都市科龍化工試劑廠），＞98%；酶（NS22086、NS22118）（Novozymes公司）。

HC-MS-100型恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；UV756CRT型紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；UItima X射線衍射儀（日本理學）S-3400N（Ⅱ）掃描電子顯微鏡。

1.3表面活性劑耦合離子液體預處理

預處理稻稈前，將離子液體在120℃下加熱30 min，并不斷攪拌，目的是去除離子液體中的水分［15］。稱取 0.5 g 稻稈加入帶螺旋塞的瓶子中，加入5 g 離子液體及1%的表面活性劑［表面活性劑（g）/離子液體（g）=1%］十二烷基硫酸鈉（SDS）或十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），置于磁力攪拌器上，在70～130℃條件下攪拌 0.5～4 h 后，加入45 ml去離子水，將混合液置于50 ml的離心管中，以7000 r·min-1高速離心15 min后分離。移出上層清液，儲存。

取下層沉淀物，用去離子水反復清洗，去除離子液體，在60 ℃真空干燥至少18 h，取出稱重，保存樣品以進行下一步的酶解實驗。

1.4木質纖維素樣品的成分分析

硝酸乙醇法和亞氯酸鈉法測定纖維素和半纖維素，濃硫酸法測定木質素［5］。

1.5木質纖維素樣品的表征

①未處理稻稈、預處理稻稈紅外譜圖（FTIR）分析

采用KBr壓片方式制備試樣，掃描范圍4000～400 cm-1。

②未處理稻稈、預處理稻稈X射線衍射（XRD）分析

采用Cu 靶產生X射線，管壓40 kV，管流20 mA，掃描步長0.02 （°）·s-1。樣品的結晶度指數利用式（1）［16］進行計算

式中，CrI表示結晶度指數，I002是晶體衍射最大強度，IAM是在2θ=16.6°的衍射強度。

式中，Cs表示晶粒大小，k表示謝樂常數，λ表示X射線波長，θ是衍射角度，Bs是最大半寬高。

③未處理稻稈、預處理稻稈掃描電鏡（SEM）分析

稻稈樣品經過一系列前處理后，用導電膠帶固定在銅臺上，噴金進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.6預處理前后的木質纖維素樣品酶解糖化

取 25 g·L-1預處理前后稻稈試樣分別置于 50 ml錐形瓶中，加入0.1 mol·L-1pH 4.8的檸檬酸鈉緩沖溶液和100 μl 0.02%疊氮化鈉溶液，搖勻，再添加50 FPU·（g稻稈）-1［實際酶活250 FPU·（g纖維素酶）-1］及40 CBU·（g稻稈）-1［實際酶活320 CBU·（g葡萄糖苷酶）-1］，置于 （50±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中，轉速為150 r·min-1下糖化0、3、6、12、24、48、72 h。反應完畢，在13500 r·min-1離心，得酶解液，取樣用DNS測定法分析還原糖含量，計算纖維轉化率［17］。

式中，c表示72 h反應生成還原糖濃度，mg·ml-1；V表示反應液總體積，ml；η表示纖維素、半纖維素的占比，%；m表示使用原始稻稈量，mg。

2　結果與討論

2.1不同預處理條件對稻稈酶解效果的分析

2.1.1預處理溫度對稻稈酶解效果的影響由圖1可以看出，由于［BMIM］Cl離子液體的熔點為65℃，故將初實驗溫度設為70℃，在反應時間為60 min條件下，研究70、90、110、130℃等不同加熱溫度的預處理效果。結果表明，預處理后稻稈酶解產糖量受預處理溫度的影響比較明顯，還原糖產量逐漸升高。主要原因是溫度升高促進生物質分子間氫鍵的斷裂，從而使大量的羥基暴露出來，有利于酶解反應。離子液體預處理生物質材料的溫度通常是110℃［12］與120℃［18-19］，固液比為1：20［19-20］，本研究由于110℃與130℃產糖量差別不大，且考慮130℃所需要的能量消耗比較多，因此選擇110℃為最佳預處理溫度，此溫度下酶解72 h的產糖量為4.897 g·L-1，其還原糖產率為32.92%。

圖1　預處理溫度對稻稈酶解效果的影響Fig.1　Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of rice straw

2.1.2預處理時間對稻稈酶解效果的影響從圖2可知，在60℃條件下，當預處理時間為30 min和60 min時得到的預處理稻稈酶解產糖量變化較明顯，而預處理時間從60 min增加到195 min產糖量只從4.897 g·L-1增加到4.969 g·L-1，其纖維轉化率從32.92%增加到33.40%，酶解產糖量變化幅度不大，推測原因為60 min已經足夠讓0.5 g的稻稈與5 g的離子液體進行充分反應，即使再增加反應時間也沒有足夠的離子液體進行反應。考慮能耗問題，以60 min為最佳預處理時間。

圖2　預處理時間對稻稈酶解效果的影響Fig.2　Effect of time on enzymatic hydrolysis of rice straw

2.1.3表面活性劑添加比例對稻稈酶解效果的影響由圖3得知，纖維素轉化率隨表面活性劑添加量增加呈先上升后下降的趨勢，在表面活性劑添加量為底物的1%時，還原糖產量達到最大。表面活性劑的添加有利于去除稻稈中的半纖維素和木質素，從而提高預處理效果。表面活性劑添加過多，可能會在溶液中形成膠團，對木質素與表面活性劑疏水基團的疏水作用產生副作用，導致酶解效果下降。

圖3　表面活性劑添加比例對稻稈酶解效果的影響Fig.3　Effect of surfactant added proportion on enzymatic hydrolysis of rice straw

圖4　表面活性劑耦合離子液體對稻稈酶解效果的影響Fig.4　Effect of surfactant-assisted ionic liquid on enzymatic hydrolysis of rice straw

2.2表面活性劑耦合離子液體對稻稈酶解效果影響

從圖4可知，所有樣品在0～24 h的酶解效果比較明顯，延長酶解至72 h產糖量基本保持不變，這是因為隨著反應時間的增加，沒有足夠的基質或纖維素酶進行反應；添加表面活性劑SDS或CTAB處理后的稻稈與未處理的稻稈相比，轉化率分別提高了53.72%和49.82%，這主要是由于在處理過程中，表面活性劑對木質素的降解有一定的促進作用，進一步降低樣品木質素的含量［21］。而在表面活性劑耦合離子液體預處理稻稈過程中，表面活性劑的添加有利于預處理過程中離子液體與底物接觸，增大離子液體的溶解能力，使處理過程更加充分，從而更容易破壞木質素的包裹作用，也使處理后稻稈中不易被酶解的成分大大降低，提高酶解產糖量。

2.3預處理前后的稻稈成分分析

由表1可看出，稻稈在最佳預處理條件下，半纖維素和木質素有明顯的下降，纖維素損失不大。其中分別單獨添加1% SDS、1% CTAB、［BMIM］Cl處理稻稈木質素的脫除率依次為12.66%、8.66%、24.98%，而1% SDS耦合［BMIM］Cl及1% CTAB耦合［BMIM］Cl預處理稻稈木質素脫除率分別提高到49.38%和34.48%。表明表面活性劑耦合離子液體處理稻稈更容易破壞木質素的包裹作用，大幅度增加纖維轉化率。

2.4紅外圖譜分析

由文獻得知［22］，3420、1160 cm-1處的吸收峰代表纖維素鍵的伸縮振動峰，2923和1641 cm-1處的吸收峰為纖維素的骨架碳鍵吸收峰；在1378 cm-1處代表纖維素鍵的彎曲振動峰。半纖維素的特征吸收峰為1740 cm-1；木質素的特征吸收峰為1510 cm-1。從圖5中明顯看出預處理后各吸收峰降低，說明處理后稻稈中分子間作用力減弱；經［BMIM］Cl、［BMIM］Cl+1% SDS、［BMIM］Cl+1% CTAB處理后的紅外光譜圖中特征峰出現的位置與未處理稻稈紅外光譜圖保持一致，表明基團結構一致，纖維素并沒有發生衍生化，也沒有新的官能團產生，只是波數有所不同，2923 cm-1處纖維素OH振動峰向高波數移動，出現“藍移”現象，這表明氫鍵作用在一定程度上減弱。其中與單獨加［BMIM］Cl預處理后的稻稈相比，加入CTAB洗滌稻稈紅外光譜圖中出現了CTAB分子的特征峰（2843 cm-1處飽和伸縮振動），說明CTAB分子與稻稈中的纖維素分子鏈接，形成較強的氫鍵，阻止離子液體處理后水洗過程中的纖維素重結晶，使得纖維素結晶度下降。在1437 cm-1和899 cm-1處的吸收強度的比值作為結晶度的指度（LOI）［12］，圖5中4個處理條件下，纖維素的結晶度分別為0.9302、0.8870、0.8750、0.8372，表面活性劑耦合離子液體處理稻稈時，纖維素結晶度下降更明顯，解釋了酶解加速的原因。

表1　R不同預處理對稻稈成分的影響Table 1　Effects of different pretreatments of rice straw on its component

圖5　不同預處理方式得到的稻稈的FTIR譜圖Fig.5　FTIR of rice straw after diffident pretreatment technology 1—untreated； 2—［BMIM］Cl； 3—［BMIM］Cl+1%SDS；4—［BMIM］Cl+1%CTAB

2.5X射線衍射（XRD）分析

從表2可以看出，與未處理稻稈相比，預處理后的稻稈結晶指數及晶體尺寸變小。與單獨離子液體處理的稻稈相比，表面活性劑耦合離子液體的稻稈結晶指數和晶體尺寸變小。表明預處理稻稈降低結晶度，有效提高酶解效果。

2.6SEM圖譜分析

從圖6中觀察發現，未處理的稻稈纖維素結構非常緊致，表面較光滑，沒有裂痕。單獨表面活性劑和單獨離子液體處理的稻稈表面的微觀形貌失去原有桿狀骨架結構，變得空洞破碎并伴有不規則空洞和凹槽。而表面活性劑耦合離子液體處理的稻稈表面遭到更大的破壞，稻稈結構變得更加疏松，完全看不出稻稈原來的桿狀骨架結構，呈不規則的顆粒狀或團狀，從而使纖維素與酶可及度增加，提高酶解效果。

表2　R不同預處理方法得到的稻稈結晶指數與晶體尺寸Table 2　Crystallinity index， crystalline size of rice straw after different pretreatment technology

圖6　不同預處理方式得到的稻稈SEM圖Fig.6　SEM of rice straw after different pretreatment technology a—untreated； b—1%SDS； c—1%CTAB； d—［BMIM］Cl；e—［BMIM］Cl+1%SDS； f—［BMIM］Cl+1%CTAB

3　結　論

（1）離子液體處理纖維素材料后在洗滌過程中，會導致纖維素重結晶，從而影響纖維素酶解的效果，添加SDS和CTAB兩種不同表面活性劑可以降低離子液體的張力，有利于處理過程中離子液體與底物更充分接觸，增加離子液體的溶解能力，提高纖維轉化率。

（2）不同表面活性劑耦合離子液體處理稻稈的最佳預處理條件：溫度為110℃，時間為60 min，SDS和CTAB添加量均為1%，72 h酶解還原糖產量分別為23.09 mg/100 mg稻稈、21.92 mg/100 mg稻稈，比未處理稻稈纖維轉化率分別提高53.72%和49.82%；與單獨離子液體處理稻稈相比，纖維轉化率分別提高了15.16%和8.00%。

（3）通過稻稈成分分析表明稻稈在110℃條件下，處理60 min，半纖維素和木質素有明顯下降，纖維素損失不大；紅外光譜圖（FTIR）表明處理后的稻稈基團結構未發生衍生化；X射線衍射（XRD）分析表明經處理后稻稈結晶指數下降，晶體尺寸也變小，說明預處理能有效降低結晶度。SEM結果顯示處理后的稻稈失去原有桿狀骨架，遭到很大程度的破壞，使纖維素與酶可及度增加，證實了酶解效果提高的合理性。

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Effect of surfactant-assisted ionic liquid pretreatment on enzymatic hydrolysis of rice straw

CHANG Ken-Lin， CHEN Ximei， HAN Yeju， WANG Xiaoqin， LI Yunying， WEN Zhang， QIU Xiaosheng
（School of Environmental Science and Engineering and Institute of Environmental Health and Pollution Control， Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006， Guangdong， China）

The enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials is a key stage for fuel ethanol production. Therefore， the pretreatment of lignocellulosic materials （as rice straw） is important to enhance the enzymatic hydrolysis saccharification. In this study， the rice straw was used as raw material and pretreatment by surfactantassisted ionic liquid. Effects of pretreatment temperature and time， and adding proportion of surfactants on the enzymatic hydrolysis of rice straw were investigated. According to the result， the optimal condition for enzymatic hydrolysis of rice straw was at 110℃ for 60 min with 1% surfactants. To compare with the ionic liquid pretreatment of rice straw， cellulose conversion was increased by 8%—15%. The improvement of enzymatic hydrolysis was confirmed by rice straw composition analysis， FTIR， XRD， SEM of untreated and pretreated rice straw.

surfactant； ionic liquid； rice straw； enzymatic hydrolysis

引　言

根據農業生物質能產業規劃（2007～2015年）［1］的估算，我國秸稈年產量達6億噸，其中水稻、玉米和小麥三大糧食作物的秸稈數量最多，分別為2.1億噸、2.09億噸與1.1億噸［2-3］。這些農業廢棄物絕大部分被燒掉或廢棄，其利用率極低，不僅造成大量資源的浪費，而且對環境造成很大的污染，若能將其轉化為生物燃料，使這些廢棄物得到綜合利用，將可大量取代交通燃料對石油、煤炭的依賴，改善自然環境。因此，以木質纖維素為原料制備生物質乙醇是生物質能源化利用的熱點技術，該技術是利用農業秸稈、城市垃圾等木質纖維素原料進行加工得到乙醇等清潔燃料。但是纖維素本身是由大量葡萄糖基構成的鏈狀高分子化合物，其結構復雜且存在大量結晶區，再加上木質素和半纖維素的包裹作用，使其很難溶于水和一般的有機溶劑［4］，降低了酶與底物的接觸機會，影響酶解糖化效率，進而影響乙醇產量，這也是環境領域中農林廢棄物綜合利用的瓶頸。因此酶解糖化是稻稈等木質纖維素材料制備生物質乙醇的關鍵環節，對稻稈等木質纖維素材料進行預處理以提高酶解糖化效率，具有重要意義。

date： 2015-09-16.

CHANG Ken-Lin， kenny @ gdut.edu.cn

supported by the Key Projects of the Agricultural Science and Technology Projects of Fujian Province （2013N0038）， the Youths Foundation of the Guangdong University of Technology （14QNZD005） and the One-Hundred Young Talents （Class A） of the Guangdong University of Technology （1143-220413105）.

X 712

A

0438—1157（2016）05—2078—06

2015-09-16收到初稿，2015-11-15收到修改稿。

聯系人及第一作者：張耿崚（1979—），男，副教授。

福建農業科技計劃重點項目（2013N0038）；廣東工業大學青年基金項目（14QNZD005）；廣東工業大學青年百人A類項目（1143-220413105）。