基于自增強Ru(Ⅱ)復合物構建的新型電致化學發光免疫傳感器檢測甲胎蛋白

廖　妮

(攀枝花學院　生物與化學工程學院，四川　攀枝花　617000)

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基于自增強Ru(Ⅱ)復合物構建的新型電致化學發光免疫傳感器檢測甲胎蛋白

廖妮*

(攀枝花學院生物與化學工程學院，四川攀枝花617000)

自增強；免疫傳感器；甲胎蛋白；金納米籠；空心納米金

甲胎蛋白(AFP)是存在于正常胎兒血清中的一種胎兒特異性蛋白質，新生兒期迅速減少。1964年，Tatarinow研究發現原發性肝癌患者的血清中存在AFP，之后大量臨床研究證實AFP對原發性肝細胞癌有高度的特異性，因此，AFP常作為診斷和檢測原發性肝癌的一個特異性臨床指標。AFP是一種分子量為6.9萬的含糖量3%的糖蛋白，在正常成人血清中的平均含量為3.4 ng/mL，但在某些腫瘤尤其是原發性肝癌患者的血清中AFP含量升高，如果成人血清中的AFP含量高于20 ng/mL，則意味著可能患有肝癌[1-6]。因次，血清中的AFP含量可作為臨床診斷某些腫瘤的指標，其研究及檢測具有重要意義。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

MPI-E型電致化學發光分析系統(西安瑞邁分析儀器有限公司、中科院長春應化所)，在檢測過程中光電倍增高壓為800 V，掃速為100 mV/s；采用三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。循環伏安測試采用CHI610A型電化學工作站(上海辰華儀器公司)，三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。不同納米復合物的形貌采用S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi Instrument公司)表征，加速電壓為20 kV。BRANSONIC 200超聲清洗儀(德國Branson Ultraschall公司)。

1.2自增強釕化合物Ru(Ⅱ)@L-Arg的合成

圖1　Ru(Ⅱ)@L-Arg化合物的合成示意圖Fig.1　A schematic diagram of the procedure used to prepare Ru(Ⅱ)@L-Arg compounds

1.3金納米籠(AuNCs)的制備

金納米籠(AuNCs)是以納米銀立方為模板，利用置換反應制得。合成步驟參考文獻[32]進行簡單的修改。①納米銀立方體(AgNCs)的合成：取30 mL乙二醇(EG)置于三頸燒瓶中，在磁力攪拌下加熱至160 ℃，然后加入10 mL含0.2 g聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液，隨后加入400 μL 3 mmol/L硫化鈉的乙二醇溶液。最后將3 mL硝酸銀的乙二醇溶液(282 mmol/L)緩慢滴加到上述溶液中，在該過程中保持溶液溫度為160 ℃，觀察到溶液的顏色由白色變為褐色時，停止加熱，室溫冷卻，用丙酮離心洗滌，將收集的納米銀立方再溶于30 mL水中。②金納米籠的制備：將制備好的30 mL納米銀立方水溶液加熱至沸，保持沸騰10 min，然后緩慢加入100 μL氯金酸(10 mg/mL)，并持續沸騰，觀察到溶液的顏色從棕色變為粉紅色，并保持不變后停止加熱，冷卻，得到金納米籠。將得到的膠體金納米籠離心洗滌，分散在PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，備用。

1.4空心納米金顆粒(HGNPs)的制備

于100 mL水中加入400 μL 0.1 mol/L的檸檬酸鈉和400 μL新制備的1.0 mol/L硼氫化鈉，室溫下通氮氣攪拌，然后加入100 μL 0.5 mol/L氯化鈷溶液，繼續通氮氣攪拌，溶液由粉紅色變成棕灰色，說明鈷離子被還原成鈷納米粒子，然后繼續攪拌10 min，使鈷離子反應完全。加大氮氣通入量，將300 μL 0.1 mol/L的氯金酸溶液緩慢滴加到混合溶液中，滴加完成后停止通氮氣，繼續室溫下攪拌，使鈷納米粒子在空氣中再氧化成鈷離子，溶液由棕灰色變成藍紫色，攪拌30 min后，將該溶液離心洗滌，然后分散到1 mL PBS(pH 7.4)緩沖溶液中得到空心納米金顆粒。

1.5巰基化碳納米管(SH-CNTs)的制備

CNTs的巰基化是通過化學手段使其表面帶巰基，具體制備過程如下：首先，為使CNTs得到更多活化的羧基基團，取2.0 mg CNTs和0.5 mg PTCA溶于5.0 mL水中，在室溫條件下攪拌12 h，通過π-π堆積作用使PTCA修飾到CNTs上[33]。向上述溶液中加入2.5 mL EDC和NHS(4∶1)混合溶液攪拌一夜，充分活化CNTs表面的羧基后，加入L-半胱氨酸(L-Cys)持續攪拌8 h，即生成表面帶巰基的CNTs(SH-CNTs)。將得到的SH-CNTs離心洗滌，分散在水中，備用。

1.6二抗復合物(Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg@BSA)的制備

取1 mL自增強Ru(Ⅱ)@L-Arg溶液，向上述溶液中加入2 mL金納米籠(AuNCs)溶液，然后加入0.2 mL anti-AFP(Ab2)，并使其在4 ℃下反應6 h。4 ℃下以10 000 r/min離心30 min除去多余的Ab2，得到產物Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg。然后將其分散于1 mL PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，向其中加入0.5 mL BSA(25 mg/mL)溶液，并于4 ℃下反應4 h以封閉AgNCs表面的非特異性結合位點。最后，通過離心得到產物Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg@BSA，并分散于1 mL PBS(pH 7.4)中，4 ℃下儲存備用。

1.7免疫傳感器的制備

電極在修飾之前，先用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉在拋光布上打磨光滑，然后分別用水和乙醇依次超聲清洗，除去表面雜質，最后用水清洗干凈，表面光滑的電極在空氣中放置，干燥備用。

電致化學發光免疫傳感器的示意圖如圖2所示：取1 mL SH-CNTs加至2 mL 0.5%的Nafion乙醇溶液并超聲處理，得到均勻的Nf-SH-CNTs懸濁液。取3 μL Nf-SH-CNTs滴加到預處理過的玻碳電極表面，在室溫下空氣中干燥，得到一層致密的Nf-SH-CNTs膜。將Nf-SH-CNTs修飾電極浸泡在10 μL空心納米金顆粒溶液中，在濕潤的條件下孵育5 h，通過Au-S鍵作用將空心納米金顆粒修飾到電極表面得到HGNPs/Nf-SH-CNTs修飾電極。取15 μL AFP抗體溶液(簡稱Ab1)在4 ℃下孵育12 h。用水沖去物理吸附的Ab1，然后孵育15 μL 1%牛血清白蛋白(BSA)1 h，用水洗滌后，將得到的免疫傳感器儲存于4 ℃備用。

圖2　電致化學發光免疫傳感器組裝過程示意圖Fig.2　Schematic diagrams of the immunosensor A:the preparation procedure of Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg(Ab2 bioconjugates)

1.8電極的測試過程

根據雙抗夾心模式，在測試之前，將免疫傳感器在常溫條件下浸于不同濃度的AFP溶液中孵育30 min。將該修飾有目標抗原的傳感器與Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg二抗復合物探針孵育40 min，通過免疫反應結合到電極表面。然后采用MPI-E型電致化學發光分析系統對所修飾電極的電致化學發光行為進行研究，測試底液為3 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)緩沖溶液。

2　結果與討論

2.1不同納米材料的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對HGNPs和AuNCs兩種納米材料進行表征(圖3)。由圖可見HGNPs是形狀規則的球形(圖3A)，球形的中間顏色較暗，說明其為空心結構，與文獻報道[34]一致。而AuNCs的形貌呈方形結構(圖3B)，與文獻[32,35]所描述的基本相似，說明AuNCs已成功制備。

2.2實驗條件的優化及機理探究

(1)

(2)

(3)

(4)

由于該傳感器用于抗原的檢測，考慮到蛋白質分子的活性問題，因此選擇對Ru(Ⅱ)@L-Arg的ECL發光性能影響較小且接近人體液體環境的pH值，即pH 7.4的PBS緩沖溶液作為檢測底液。

圖3　HGNPs(A)和AuNCs(B)的掃描電鏡表征圖Fig.3　SEM images of HGNPs(A) and AuNCs(B)

圖4　裸玻碳電極在Ru(Ⅱ)@L-Arg,Ru(Ⅱ),Ru(Ⅱ)+ L-Arg中的ECL響應對比Fig.4　ECL responses of the bare GCE in PBS(pH=7.4)(a), containing Ru(Ⅱ)(b),containing Ru(Ⅱ) and L-Arg(c), containing Ru(Ⅱ)@L-Arg(d)

進一步考察了體系中自增強Ru(Ⅱ)@L-Arg,Ru(Ⅱ)和Ru(Ⅱ)+L-Arg的ECL響應情況(如圖4)，在掃描電壓0.2～1.25 V范圍內，分別將裸玻碳電極在Ru(Ⅱ)、Ru(Ⅱ)@L-Arg的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中進行掃描，并在Ru(Ⅱ)的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中加入L-Arg對裸玻碳電極進行掃描。結果表明,在PBS中加入L-Arg后Ru(Ⅱ)的ECL強度(曲線c)明顯高于未加L-Arg(曲線b)時的強度，但低于Ru(Ⅱ)@L-Arg(曲線d)的ECL強度。而裸玻碳電極在PBS(pH 7.4)緩沖溶液底液中進行掃描時無ECL信號(曲線a)。實驗結果顯示，Ru(Ⅱ)@L-Arg自增強化合物可得到更強的發光強度。這表明分子內ECL反應因縮短了電子傳輸路徑，減少了能量損失，可以得到比分子間ECL反應更強的發光強度。

圖5　電極不同修飾階段的循環伏安圖Fig.5　Cyclic voltammograms(CVs) of different modified electrodes a.GCE,b.Nf-SH-CNTs/GCE,c.HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE, d.anti-AFP/HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE,e.BSA/anti-AFP/ HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE,f.AFP/BSA/anti-AFP/HGNPs/ Nf-SH-CNTs/GCE,g.Ab2/AuNCs/Ru(Ⅱ)@L-Arg/AFP/ BSA/anti-AFP/HGNPs/Nf-SH-CNTs/GCE；insert:EIS plots of different modified electrodes；buffer:0.1 mol/L PBS0.1 mol/L KCl

2.3電極修飾過程的循環伏安及電化學交流阻抗性能表征

采用電化學交流阻抗技術(EIS)對電極的每一步修飾進行表征(圖5插圖)。由裸玻碳電極的阻抗圖(曲線a)可以看到本體阻抗較小，說明裸玻碳電極具有很好的導電性能。當巰基化的碳納米管修飾到玻碳電極上后(曲線b)，半圓直徑減小，說明電極阻抗值減小，表明巰基化的碳納米管能促進電子傳輸。引入HGNPs后，由于HGNPs具有良好的電子傳輸能力且增大了電極的比表面積，所以半圓直徑顯著減少，說明電極阻抗值繼續降低(曲線c)。Anti-AFP蛋白分子固載到電極表面后，電極阻抗值明顯增大(曲線d)，這是由于形成了蛋白質分子層，不利于電子的傳輸。用BSA封閉多余結合位點(曲線e)，進一步孵育上抗原(曲線f)，然后孵育二抗偶合物(曲線g)。電極阻抗值持續增大，這是由于蛋白質層阻礙了電極表面電子的傳輸。

2.4免疫傳感器的性能

2.4.1免疫傳感器對AFP的電致化學發光響應特性在優化條件下，通過夾心免疫反應策略測定了不同標準濃度的AFP抗原對應的ECL響應。結果顯示ECL響應信號隨抗原濃度的增加而不斷增加，在1.0×10-5～1.0×10-3ng/mL范圍內，ECL強度(I)與AFP抗原濃度(c，ng/mL)的對數值呈良好的線性關系,線性方程為I=2 252 lgc+11 662，相關系數(r2)為0.993;檢出限(S/N=3)為3.3×10-6ng/mL。將該方法與已報道的其他檢測AFP的方法進行比較(見表1)，結果可見本方法對于AFP的檢測具有較好檢出限和較寬的檢測范圍。

表1　該實驗方法與其他檢測AFP方法的對比

2.4.2免疫傳感器的穩定性、重現性及選擇性考察了該ECL免疫傳感器的穩定性，將目標傳感器在測試底液中連續掃描10圈，其ECL的響應變化很小，說明該傳感器的穩定性很好。取10支制備的ECL免疫傳感器，分別對1 pg/mL的AFP標準溶液進行檢測，測得10支傳感器結果的相對標準偏差(RSD)為2.3%，表明該免疫傳感器具有良好的精確性和重現性。

選擇高濃度的癌胚抗原(CEA)、免疫球蛋白G(IgG)和牛血清白蛋白(BSA)作為干擾物質，考察了該免疫傳感器的選擇性。結果顯示，當無目標抗原時，傳感器對3種干擾物混合溶液的ECL響應與空白時的ECL響應無明顯差異，說明該傳感器的非特異性吸附很小，而將干擾蛋白摻入目標蛋白得到的ECL信號與只有目標抗原時獲得的ECL響應信號差異也很小(RSD為2.5%)，說明在有其他干擾蛋白存在時制得的免疫傳感器對AFP的檢測特異選擇性也比較理想。

2.4.3免疫傳感器的回收率測定為進一步研究該免疫傳感器的實際應用價值，配制含不同濃度AFP(0.05,0.10,0.50,1.00 ng/mL)的血清樣品，用制備的傳感器對其進行檢測，結果顯示，該免疫傳感器的回收率分別為106.0%，98.0%，106.0%，102.0%，可較好地應用于人血清樣品中AFP的直接檢測。

3　結　論

本文利用共反應試劑和發光體形成一個分子，合成了一種新型的ECL發光體Ru(Ⅱ)復合物?；谠揜u(Ⅱ)的復合物，以金納米籠作為固載基質構建了一個信號增強型的免疫傳感器用于AFP抗原檢測,此ECL系統表現出顯著增強的電致化學發光效率和穩定性，且無需添加共反應試劑。該ECL免疫傳感器為超低濃度蛋白質的檢測提供了一種方法參考，并為生物分子檢測和生物分析提供了新的可能性。

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Detection of α-Fetoprotein Using a Novel Electrochemiluminescence Immunosensor Based on Self-enhanced Ru(Ⅱ) Complex

LIAO Ni*

(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua617000，China)

self-enhanced；immunosensor；α-fetoprotein；Au nanocages；hollow gold nanospheres

2015-12-20；

2016-01-22

國家自然科學基金資助項目(21575116)

廖妮，碩士，助教，研究方向：納米材料與生物傳感器，Tel:0812-3370459，E-mail:707584550@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.009

O657.1；O629.7

A

1004-4957(2016)07-0832-07