基于氮摻雜多孔碳的乙酰膽堿酯酶傳感器檢測殘留農藥甲拌磷

吳建宏，呂冰婧，衛　偉*

(1.華東石油技師學院，江蘇　揚州　225129；2.東南大學　化學化工學院，江蘇　 南京　211189)

?

基于氮摻雜多孔碳的乙酰膽堿酯酶傳感器檢測殘留農藥甲拌磷

吳建宏1，呂冰婧2，衛偉2*

(1.華東石油技師學院，江蘇揚州225129；2.東南大學化學化工學院，江蘇 南京211189)

以制備的新型氮摻雜多孔碳為載體，玻碳電極(GC)為工作電極，構建了乙酰膽堿酯酶(AChE)傳感器，用于有機磷農藥甲拌磷的檢測研究。在1.0 mmol/L底物氯化乙酰膽堿溶液中的差分脈沖掃描結果表明，AChE/GC電極上的峰電流為0.195 8 μA，而AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極上的峰電流為0.841 4 μA，說明氮摻雜多孔碳材料可有效固定AChE，提高檢測靈敏度。采用AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極對不同濃度甲拌磷進行測定，在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內，抑制率與甲拌磷濃度的負對數呈良好的線性關系(r2=0.998 5)。按照抑制率為10%計算，檢出限為5.8×10-12g/L。采用加標回收法檢測菠菜汁樣品中的甲拌磷，回收率為91.7%～97.4%。

甲拌磷；氮摻雜多孔碳；乙酰膽堿酯酶；氯化乙酰膽堿

甲拌磷屬于內吸性有機磷殺蟲劑，因高效、低價而在農業生產中廣泛應用。近年來的大規模過量和不規范使用，導致甲拌磷在環境和農產品中的殘留量日益增加[1]。環境中殘留的甲拌磷可被氧化成更高毒性的氧化物，具有較長的殘效期，對人類健康造成潛在威脅。殘留在農產品中的甲拌磷可通過食物鏈進入人體，在體內抑制膽堿酯酶活性，造成神經生理功能紊亂，短期內接觸或大量接觸會引起急性中毒，嚴重時將出現肺水腫、腦水腫、昏迷、呼吸麻痹等癥狀，甚至導致遲發性猝死。因此，對甲拌磷殘留進行檢測具有重要意義。

檢測甲拌磷的常用方法有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法等，這些方法的選擇性、準確度和靈敏度較高，但所需儀器設備昂貴，檢測周期較長，不適合現場快速檢測[2-3]?；谝阴Ｄ憠A酯酶(AChE)傳感器的電化學方法具有簡單、快速、便攜等優點，已成為當前的研究熱點之一[4-6]。其中，如何選擇酶固定材料和提高檢測靈敏度，是AChE傳感器制備中需要解決的關鍵問題。由于具有大的比表面積、強的吸附能力、良好的導電性和生物相容性等優點，許多碳納米材料如碳納米管[7-8]、碳球[9]、碳氣凝膠[10]等被廣泛用于構筑AChE傳感器，以保護和提高酶的活性，達到提高檢測靈敏度的目的。然而，純碳材料的親水性較差，在一定程度上限制了其應用。氮原子在元素周期表中處于碳原子相鄰位置，可取代碳材料中的碳原子。研究表明，在碳納米材料中摻雜氮原子可以極大地改變材料的表面結構、調控其孔道結構、增強其親水性、改善材料的電子傳輸速率，從而擴大碳納米材料在電化學領域的應用范圍[11-12]。

本實驗基于多孔碳材料的高導電性、良好生物相容性及大比表面積等優點[13]，通過摻雜氮原子對多孔碳材料進行功能化，強化多孔碳材料固有的優異性能并賦予其新功能，用于制備AChE傳感器并進行甲拌磷的電化學檢測研究。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

氯化乙酰膽堿(ATCl)和乙酰膽堿酯酶(C3389型)購于Sigma公司，甲拌磷標準溶液(分析純)購于中國藥品生物制品檢定所。實驗所用化學試劑均為分析純。

CHI-660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)，三電極體系:玻碳電極(GC)為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極。

1.2實驗內容

1.2.1氮摻雜多孔碳材料的制備氮摻雜多孔碳材料的制備采用離子液體1-丁基-三甲基咪唑二氰胺鹽(BMIMdca)為前驅體，二氧化硅球為硬模板。首先，采用St?ber法制備直徑約300 nm的二氧化硅球。分別取1.0 g二氧化硅球和1.0 g BMIMdca離子液體加入50 mL水中，超聲分散30 min，室溫下攪拌4 h。混合物加熱至100 ℃除去水，產物在氮氣保護下進行炭化處理，以10 ℃/min升溫至800 ℃，保持3 h，然后采用10% HF溶液除去二氧化硅模板。經過濾、洗滌、80 ℃干燥12 h后，獲得氮摻雜多孔碳[14]。

1.2.2AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器的制備GC電極依次用無水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗，晾干后使用。用移液槍移取6 μL的120 U/mL AChE-0.50%戊二醛-1%牛血清蛋白混合液(1∶1∶1)于離心管中，再移取5 μL、1 mg/mL氮摻雜多孔碳材料，在渦流振蕩器上混勻后，滴加在GC電極上，室溫下晾干，即制得AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器。

2　結果與討論

2.1AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器的電化學表征

考察了裸GC電極、氮摻雜多孔碳/GC電極和AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含0.10 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗譜圖(見圖1)。如圖所示，裸GC電極的電阻約為120 Ω，氮摻雜多孔碳修飾后的GC電極電阻為33 Ω，說明氮摻雜多孔碳材料具有較高的電催化活性，可以加快電極表面的電子轉移。其中AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極的電阻最大(約為240 Ω)。這是因為AChE為非導電物質，可以阻礙電子轉移，而電阻的增大表明酶已被很好地固定在電極上。

2.2底物氯化乙酰膽堿在不同電極上的電化學行為

采用差分脈沖法考察了不同電極在1.0 mmol/L ATCl底物溶液中的響應信號(見圖2)，結果發現AChE/GC電極上的峰電流為0.195 8 μA，AChE/多孔碳/GC電極上的峰電流為0.290 5 μA，AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極上的峰電流為0.841 4 μA。與AChE/GC電極相比，經多孔碳和氮摻雜多孔碳固定AChE后，氧化峰電流值分別增加了48.37%和329.72%。由此可知，采用多孔碳和氮摻雜多孔碳固定AChE均可以提高AChE的酶活性，增大電流響應信號。而且采用多孔碳材料中摻雜氮原子可以極大地改變材料的表面結構，增強親水性，改善材料的電子傳輸速率，從而使其具有更高的電催化活性，更大程度地提高檢測靈敏度。

分別在濃度范圍為0.005～2 mmol/L 的底物ATCl溶液中，掃描了AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極的時間～電流曲線。結果發現，初始隨著底物濃度的增大，反應速率逐漸增大，電流響應值增加明顯，表明AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器對底物ATCl有很大的親和力及催化活性。隨著底物濃度繼續增大，反應速率增大的趨勢逐漸減緩，說明傳感器上底物ATCl的濃度已飽和。底物濃度(C,mmol/L)分別在0.05～0.55 mmol/L和0.6～1.0 mmol/L范圍內與峰電流(Ip,μA)呈良好的線性關系，線性方程分別為Ip=0.434 2C+0.076 9(r2=0.987 4)；Ip=0.160 7C+0.224 3(r2=0.981 6)。

2.3甲拌磷農藥的檢測

底物氯化乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶的催化作用下水解產生乙酸和膽堿。而膽堿在電極表面能夠發生氧化反應，產生電流響應。甲拌磷可與乙酰膽堿酯酶形成非共價鍵中間復合物，即磷?；憠A酯酶，從而抑制酶活性，阻礙氯化乙酰膽堿水解，進而降低產物膽堿的氧化峰電流，且峰電流下降的程度與甲拌磷對酶的抑制程度相關，因此可通過抑制率變化檢測甲拌磷的含量。對甲拌磷抑制前后的AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極進行差分脈沖掃描，結果顯示，未加入甲拌磷時，電極上產生的氧化峰電流為0.841 4 μA，加入6.0×10-7g/L甲拌磷抑制后，電極上產生的氧化峰電流降為0.388 9 μA。根據抑制率計算公式A=[(I0-I)/I0]×100%(式中A為抑制率,I0為未加甲拌磷標準溶液時的峰電流值,I為加入甲拌磷標準溶液抑制后的峰電流值)，得到抑制率為53.77%。

在1.0 mmol/L的ATCl溶液中加入6.0×10-7g/L甲拌磷標準溶液后，每隔2 min進行差分脈沖伏安法掃描，考察甲拌磷對酶的最佳抑制時間。實驗結果顯示，隨著抑制時間的增加，抑制率逐漸增大，當抑制時間達10 min后，增幅相對平緩。所以選擇10 min作為最佳抑制時間。

2.4標準曲線的建立

利用AChE/氮摻雜多孔碳/GC電極，在6.0×10-13～1.2×10-5g/L濃度范圍內加入不同濃度的甲拌磷標準溶液，10 min后進行差分脈沖伏安法掃描，計算甲拌磷的抑制率，作濃度負對數與抑制率的關系曲線圖。結果表明，抑制率隨其濃度的增加而增加，在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內，抑制率(A)與甲拌磷濃度(X,g/L)的負對數呈良好的線性關系，線性方程為A(%)=-9.089 7X+112.106 8,r2=0.998 5。按照抑制率為10%進行計算，得到檢出限為5.8×10-12g/L。

2.5實際樣品的檢測

制備菠菜汁空白樣品，采用加標回收法，分別加入9.6×10-8，9.6×10-7g/L的甲拌磷標準溶液，用AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器檢測樣品的回收率。測得樣品的回收率為91.7%～97.4%，相對標準偏差(RSD)不大于11.5%。相比于其他檢測方法[15-16]，本方法的靈敏度更高，檢測范圍更寬，具有良好的應用前景。

3　結　論

本實驗通過制備氮摻雜多孔碳材料固定AChE，構建了AChE/氮摻雜多孔碳/GC傳感器用于農藥殘留甲拌磷的檢測研究。實驗結果表明，氮摻雜多孔碳材料可以有效固定AChE，提高甲拌磷的檢測靈敏度。在6.0×10-10～1.2×10-6g/L濃度范圍內，抑制率與甲拌磷濃度的負對數呈良好的線性關系，檢出限為5.8×10-12g/L。菠菜汁樣品的加標回收率為91.7%～97.4%。該方法操作方便、快速，具有較強的經濟適用性。

[1]ChenJP,PehkonenSO,LauCC.Colloid Surf.A,2004,240(1/3):55-61.

[2]BallesterosE,ParradoMJ.J.Chromatogr.A,2004,1029(1/2):267-273.

[3]ZhouJ,ZhuangJY,MiroM,GaoZQ,ChenGN,TangDP.Biosens.Bioelectron.,2012,35(1):394-400.

[4]RotariuL,ZamfirLG,BalaC.Anal.Chim.Acta,2012,748:81-88.

[5]ZhangL,LongLJ,ZhangWY,DuD,LinYH.Electroanalysis,2012,24(8):1745-1750.

[6]WuLN,CaoXZ,CaiJH.J.Instrum.Anal.(吳麗娜，曹錫忠，蔡建和.分析測試學報)，2016,35(2):241-244.

[7]SharmaSP,TomarLNS,AcharyaJ,ChaturvediA,SuryanarayanMVS,JainR.Sens.Actuator B,2012,166:616-623.

[8]RongJF,WeiH,HuangHS,LiYJ,XuMZ.J.Instrum.Anal.(榮杰峰，韋航，黃伙水，李亦軍，許美珠.分析測試學報)，2016,35(1):8-15.

[9]WeiM,ZengGY,LuQY.Microchim.Acta,2014,181(1/2):121-127.

[10]LiuY,WeiM.Food Control,2014,36(1):49-54.

[11]GongKP,DuF,XiaZH，DurstockM，DaiLM.Science,2009,323(5915):760-764.

[12]ZhengY,JiaoY,ChenJ，LiuJ，LiangJ，DuA，ZhangWM，ZhuZH，SmithSC，JaroniecM.J.Am.Chem.Soc.,2011,133(50):20116-20119.[13]WeiM,WangJJ.Sens.Actuator B,2015,211:290-296.

[14]LiuY,ZhangYM,ZhaiCP,LiXY,MaoLQ.Mater.Lett.,2016,166:16-18.

[15]FuGL,ChenWW,YueXL,JiangXY.Talanta,2013,105:110-115.

[16]BalaR,SharmaRK,WangooN.Sens.Actuator B,2015,210:425-430.

Detection of Phorate Using Acetylcholinesterase Biosensor Based on Nitrogen-doped Porous Carbon

WU Jian-hong1,Lü Bing-jing2,WEI Wei2*

(1.East China Petroleum Technician College，Yangzhou225129,China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Southeast University,Nanjing211189,China)

Nitrogen-doped porous carbon was used to immobilize acetylcholinesterase(AChE) to fabricate biosensor for the detection of organophosphorus pesticide phorate.The peak current was 0.195 8 μA at the AChE/GC electrode,while 0.841 4 μA was obtained at AChE/nitrogen-doped porous carbon/GC electrode,indicating that nitrogen-doped porous carbon can effectively immobilize AChE and enhance the sensitivity.The inhibition rate versus logarithm of phorate were linear in the range of 6.0×10-10-1.2×10-6g/L,with a correlation coefficient(r2) of 0.998 5.The detection limit of phorate,calculated by inhibition rate of 10%,was 5.8×10-12g/L.The sensor could be used for the detection of phorate in spinach juice with recoveries of 91.7%-97.4%.

phorate；nitrogen-doped porous carbon；acetylcholinesterase；acetylcholine

2016-03-09；

2016-03-16

國家自然科學基金(21475020)

衛偉，博士，教授，研究方向：分析化學，Tel：025-52090613，E-mail：wei_wei98@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.022

O657.1；F767.2

A

1004-4957(2016)07-0897-04