絲素蛋白纖維人工韌帶的制備及性能分析

吳惠英， 周　燕， 左保齊

(1. 蘇州經貿職業技術學院 紡織服裝與藝術傳媒學院，江蘇 蘇州215009； 2. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215006；3. 現代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123)

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研究與技術

絲素蛋白纖維人工韌帶的制備及性能分析

吳惠英1,2， 周燕1， 左保齊2,3

(1. 蘇州經貿職業技術學院 紡織服裝與藝術傳媒學院，江蘇 蘇州215009； 2. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215006；3. 現代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123)

絲素具有良好的生物相容性，作為組織工程材料引起廣泛關注。因此，結合天然絲素和再生絲素仿真構建人工韌帶，在立式錠子編織機上，以再生絲素長絲為軸紗、外包天然絲素纖維編織管狀結構的織物復合構建人工韌帶。研究表明：采用CaCl2-FA溶液可常溫條件下快速溶解蠶絲獲得再生絲素溶液，通過濕法紡絲技術能夠制備表面光滑且力學性能良好的再生絲素長絲。選擇天然絲素纖維編織層數為9層、角度為2θ=45°±2°、中間包裹400根再生絲素長絲構建絲素蛋白纖維人工韌帶，該韌帶材料的斷裂強力可達(1 942.6±7.5)N。體外降解實驗表明，韌帶材料中再生絲素長絲較天然絲素纖維有更快的降解速度。

氯化鈣/甲酸；天然絲素；再生絲素長絲；人工韌帶；性能；降解

人體前交叉韌帶是膝關節中的重要組成部分，由致密的纖維結締組織結構構成，其中Ⅰ型膠原約占90%，Ⅲ型、Ⅳ型膠原約占10%。縱行、致密的Ⅰ型膠原組成了直徑約為20 μm的纖維，被較細的Ⅲ型膠原分隔成直徑20～400 μm的纖維束[1-2]。前交叉韌帶中大多數的纖維束呈縱向排列，其中也有部分纖維束呈螺旋排列[3]。目前由于劇烈運動、交通事故等因素造成的前交叉韌帶的損傷現象呈逐漸上升的趨勢。對于人工韌帶的修復材料而言，提供足夠的抗拉強度及良好的抗磨損能力是延長人工韌帶使用壽命的關鍵因素，此外，還應具有良好的生物相容性，對人體無害、無過敏反應等性質。

在眾多的人工韌帶修復材料中，Altman等[4]采用蠶絲設計了鋼纜式韌帶，但鋼纜式結構中蠶絲間排列緊密，細胞只能在支架表面上生長，很難進入支架內部。Liu等[5]將絲素制備成框架型結構后浸入到絲素溶液中形成三維空間結構構建人工韌帶修復材料，但其穩定性很難控制。此外，Cooper等[6]用乳酸乙醇酸共聚物纖維結合表面多孔化技術設計人工韌帶，Lu等[7]以聚乳酸和聚對苯二甲酸乙二脂為原料，Ide等[8]將聚左旋乳酸和Ⅰ型膠原混合編織，Chen等[9]將Ⅰ型膠原微孔海綿與乳酸乙醇酸共聚物結合表面網狀孔隙結構等方式構建人工韌帶。目前在臨床中使用的LARS韌帶是以滌綸為原料構建的人工韌帶，它能夠提供良好的機械性能，30根滌綸長絲構建的韌帶材料的抗拉強力達到1 500 N，80根可達3 600 N[10]，但其仍屬于永久型人工韌帶，無法在體內降解，不能引導細胞生長促進人體自身韌帶組織的形成。

蠶絲是由多種氨基酸組成的天然蛋白質，具有獨特的理化性質及良好的生物相容性，近年來在眾多生物醫用高分子材料中脫穎而出，是一種可制備成如再生長絲、靜電紡納米纖維、水凝膠等多種形態的材料。本文以天然絲素和再生絲素長絲為原料，以管狀結構作為人工韌帶的基本結構，其中再生絲素長絲為芯紗、天然絲素纖維作為外包紗共同編織，充分發揮絲素材料的良好生物相容性，以及再生絲素長絲的可降解性和天然絲素的優良力學性質，開發可降解型人工韌帶修復材料。采用氯化鈣/甲酸(CaCl2-FA)溶解蠶絲獲得再生絲素溶液，通過濕法紡絲技術制備再生絲素長絲。優化天然絲素纖維的編織角度，以再生絲素長絲為芯紗構建力學性能較好的人工韌帶修復材料。通過體外降解實驗表征以天然絲素和再生絲素長絲構建的韌帶材料的降解行為。

1　實　驗

1.1材料與儀器

1.1.1材料

桑蠶絲(線密度為65 dtex，浙江湖州宏成紡織有限公司)，無水碳酸鈉(Na2CO3，分析純，上海試劑總廠)，無水氯化鈣(CaCl2，分析純，上海試劑總廠)，98%甲酸(FA，分析純，江蘇強盛化工有限公司)，磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4，上海雙螺旋生物科技有限公司)，放線菌蛋白酶(Actinomycetes protease，活性單位3.5 U/mg，Sigma公司)。

1.1.2儀器

Hitachi S-570型掃描電鏡(Hitachi Limited，日本)，NICOLET 5700智能型傅立葉紅外光譜儀(Thermo Nicolet Corporation，美國)，Instron萬能材料試驗機(Instron，美國)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，YTS 2-24型立式錠子編織機(溢泰織造機械有限公司)，MT-Ⅲ型009-300-S-D脈動無級變速器(國營寧波海洋漁業公司漁機廠)。

1.2再生絲素長絲的制備

1.2.1脫膠過程

用質量分數為0.05%的碳酸鈉(Na2CO3)溶液按1︰20的浴比沸煮一定量的桑蠶絲，沸煮時間30 min，反復脫膠3次，每次脫膠后用60 ℃以上的去離子水清洗，放在60 ℃條件下的烘箱里烘干，備用。

1.2.2絲素的溶解及再生絲素長絲的制備

將脫膠桑蠶絲溶于CaCl2質量分數為5.0%、FA質量分數為95.0%的混合溶液中制備質量分數為15.0%的再生絲素溶液，溶解時間約2～4 h，所得溶液在常溫下具有良好的流動性。采用濕法紡絲技術進行再生絲素長絲的制備。紡絲工藝為：紡絲溫度25 ℃；凝固浴去離子水；凝固槽長度1.5 m；紡絲壓力0.1 MPa；紡絲速率5 mL/h；卷繞速率10 r/min。

1.2.3人工韌帶的編織工藝

采用立式錠子編織機進行編織，二維錠子編織機是由傳動機構、軌道盤、攜紗器、成型器及牽拉裝置組成，攜紗器的運動軌跡為“8”字型，該設備操作簡單，編織速度可控，兩組紗線互相交錯形成管狀織物(圖1)，織物管徑可根據實際需要進行調整。

圖1　立式錠子編織機及其運動方式Fig.1　Vertical spindle weaving machine and its movement way

1.3測試分析

1.3.1形貌觀察

利用掃描電鏡觀察再生絲素長絲的表面形貌，噴金厚度20～30 nm。利用Canon 650D相機高清拍攝韌帶材料的形態，放大后測量紗線間夾角，并分別命名為人工韌帶NSF-1，人工韌帶NSF-2。

1.3.2力學性能測試

利用萬能材料試驗機測定材料的力學性能。力學性能測試前，先將樣品置于恒溫恒濕(溫度為20 ℃±2 ℃，相對濕度為65%±2%)條件平衡24 h，夾持長度40 mm，拉伸速率為20 mm/min，預張力0.2 N，樣品測試5個。

1.3.2體外降解性實驗

放線菌蛋白酶于37 ℃溶解于0.05 mol/L (pH=7.4)的PBS溶液中，得到5 U/mL的放線菌蛋白酶溶液。降解過程中每隔2 h取出樣品，同時用新配制的酶溶液更換原來的酶溶液，使其他的樣品繼續降解，酶溶液的體外降解實驗持續15 d。取出的樣品加入50 mL蒸餾水浸泡1 d，反復清洗，除去無機鹽，室溫干燥。將降解后的材料干燥后進行表面形貌觀察。

2　結果與分析

2.1再生絲素長絲的性能

2.1.1再生絲素長絲的表面形貌

濕法紡絲過程中，紡絲液細流與凝固劑接觸后，改變了紡絲液細流的相平衡，使聚合物和溶劑分離，紡絲液中的溶劑和鹽向外擴散，凝固劑向內擴散，最終形成固相的纖維。前期的研究過程中發現[11-13]，采用CaCl2-FA溶解方式可以快速制備得到再生絲素溶液，不需要濃縮即可紡絲，更為重要的是絲素溶液中含有尺寸不一的納米原纖結構，而原纖結構正是天然蠶絲優良力學性能的關鍵因素。因此，采用含有原纖結構的絲素溶液進行紡絲，所得再生絲素長絲的性能也會有所提高。通過纖維的表面形貌觀察發現(圖2)，采用質量分數為15%的再生絲素溶液所制備的再生絲素長絲表面光滑，直徑均勻，纖維直徑為(11.2±3.5)μm，內部結構緊密；將其纖維表面放大5萬倍時，纖維表面可以清晰觀察到原纖結構，這說明再生絲素溶液中的納米原纖結構在濕法紡絲過程中又重組成再生絲素長絲。

圖2　再生絲素長絲的表面形貌Fig.2　Morphologies of silk fibroin filaments

2.1.2再生絲素長絲的力學性能

將再生絲素長絲分別拉伸2、3、4倍后進行力學性能測試，結果如表1所示。拉伸處理可以進一步提高長絲的取向排列和結晶度，從而使長絲的力學性能得到改善，表1顯示牽伸4倍后纖維的斷裂應力可達(358.4±43.2)MPa。

表1　不同倍數拉伸后絲素長絲的力學性能Tab.1　Mechanical properties of SF filaments under different drawing ratios

2.2天然絲素纖維韌帶材料的力學性能

2.2.1材料的受力分析及編織角度的選擇

圖3　人體韌帶的力學行為特征Fig.3　Mechanical behavior features of human ligament

人體前交叉韌帶在外力拉伸過程中表現出三個階段的行為變化[14]，如圖3所示。非線性區：在低應力作用下韌帶的變形不明顯。在這一過程中，當外力作用于韌帶組織時，首先將力轉移到膠原纖維中導致纖維間橫向的收縮，同時纖維中卷曲的結構被拉直。線性區：在這一階段斜率增加，隨著纖維卷曲的結構被拉直后，外力會直接作用到膠原分子中。膠原纖維的螺旋結構被拉直，同時橫向連接的原纖結構發生相對滑移，導致單位應變下應力的增加，斜率增加。屈服區：在這一區域表現為斜率的下降，同時原纖結構斷裂。在這一區域，韌帶中原纖結構的斷裂導致膠原纖維斷裂，最終引起韌帶斷裂，應力-應變曲線中斜率降低。為了更好地恢復膝關節作用，韌帶替代材料需要具備與正常前交叉韌帶相似的生物力學性質才能更好發揮韌帶的功能作用。本文分別采用兩種角度進行韌帶材料的編織，放大后測量兩種韌帶材料紗線間的夾角2θ分別為45°±2°和95°±2°，其中θ為編織角，實物如圖4所示，材料拉伸時的受力分析如圖5所示。

圖4　不同編織角度構建的人工韌帶材料Fig.4　Artificial ligament constructed with different braiding angle

圖5　人工韌帶材料拉伸過程受力分析Fig.5　Analysis of stress of artificial ligament in stretching process

由圖5可知，材料所受力的作用滿足關系式：

B=TSX=TS·sinθ

(1)

T=TSy=TS·cosθ

(2)

式中：θ為編織角；T為軸向拉力；B為法向力；Ts為沿紗線方向拉力。

編織角度是影響韌帶材料受力過程中非線性區的長度及斷裂強力的關鍵因素。隨著編織角度的增加，外力首先是將與軸向呈一定夾角的紗線由偏移軸方向的位置拉伸轉移至與軸平行的位置，然后再作用于這些被拉直的紗線。本文以天然絲素纖維構建的NSF-1，即2θ=45°±2°，力的作用首先是將紗線從與軸向呈夾角的位置轉移到與軸向平行的位置，即在低應力作用下韌帶材料發生的變形，變形會持續一段時間直至伸直，再將外力轉移至與軸向平行的紗線中。在這一過程中，材料的變形及受力情況與人體前交叉韌帶變形過程很相似。隨著編織角度的繼續增加，如本文的天然絲素纖維構建的NSF-2，即2θ=95°±2°，紗線間夾角過大，當外力作用于紗線后，紗線由傾斜到與軸向平行的轉變過程所需時間較長，形變量過大。因此綜合考慮形變及斷裂強力等因素，本文選用2θ=45°±2°作為天然絲素纖維的編織角度。

2.2.2力學性能測試

為了討論不同層數對材料力學性能的影響，采用兩種不同編織角度分別編織1、3、6、9層，圖6為NSF-1、NSF-2的力學性能。圖6可見，隨著編織層數的增加，材料的斷裂強力逐漸增加。力學測試結果表明，NSF-1的編織層數為9層，紗線間夾角2θ=45°±2°時，材料的斷裂伸長為33.5%±6.1%，與人體前交叉韌帶的斷裂伸長率約為33%相近。同時，材料的斷裂強力達到(1523.2±18.3)N，與人體前交叉韌帶的斷裂強力(2160±157)N[4]相近。而NSF-2的編織層數為9層，紗線間夾角2θ=95°±2°時，斷裂強力和斷裂強度與NSF-1的結果相近，但斷裂伸長率達到了63.7%±2.5%，幾乎達到了人體前交叉韌帶斷裂伸長率的2倍，變形較大。這與前面所討論的受力分析過程中紗線夾角與力學行為間的關系結論一致。

2.3絲素蛋白纖維人工韌帶的構建及性能

2.3.1絲素蛋白纖維人工韌帶的構建

將制備的再生絲素長絲集束收集后平行排列作為軸紗、天然絲素纖維作為外包紗線相互交錯進行編織構建絲素蛋白纖維人工韌帶修復材料，如圖7所示。結合人體斷裂強力、斷裂伸長率、斷裂強度等參數，選擇天然絲素纖維編織層數為9層，編織角度控制在2θ=45°±2°，中間包裹400根再生絲素長絲構建絲素蛋白纖維人工韌帶。在該結構中既有平行排列又有相互交叉排列的兩種纖維共同組成，結構形態上與人體前交叉韌帶相近。

圖7　絲素蛋白纖維人工韌帶的構建Fig.7　Construction of artificial ligament with silk fibroin

2.3.2絲素蛋白纖維人工韌帶的力學性能

將絲素蛋白纖維人工韌帶進行力學性能測試，結果如表2所示。在受到外力拉伸作用后，包裹在芯部的長絲受到外包天然絲素纖維的保護，天然絲素纖維首先受到力的作用，隨著纖維間的夾角逐漸

表2　絲素蛋白纖維人工韌帶的力學性能Tab.2　Mechanical properties of artificial ligaments constructed with silk fibroin

減小，兩種纖維都受到外力作用，其最終的斷裂強力可以達到(1 942.6±7.5)N，較純天然絲素纖維構建的人工韌帶在力學性能上有所提高，這說明再生絲素長絲在其中起到了一定的作用。

2.3.3絲素蛋白纖維人工韌帶的降解性能

將絲素蛋白纖維人工韌帶放置于放線菌蛋白酶溶液中進行體外降解實驗，分別在降解5 d(圖8)和15 d(圖9)時選擇天然絲素纖維中最外層、最里層及位于芯紗部位的再生絲素長絲進行表面形貌觀察。研究發現，天然絲素纖維在降解液中的性質較穩定，降解5 d時纖維幾乎沒有發生變化，而處于芯部的再生絲素長絲在外包纖維的保護下，其纖維形態也較完整。當降解15 d時，隨著降解液對纖維的不斷降解，外層的天然纖維出現了劈裂現象，而里層纖維仍保持規整的結構。然而隨著外層纖維發生逐漸降解，降解液滲透到內部，對再生絲素長絲作用逐漸加強，再生絲素長絲纖維降解嚴重、形態模糊。降解實驗表明，在絲素蛋白纖維人工韌帶材料中，表現出天然絲素纖維降解速度緩慢、再生絲素長絲降解速度快的降解差異，實現了可降解型人工韌帶的設計要求。

圖8　材料降解5 d時纖維表面形貌觀察Fig.8　Morphologies of fibers after degradation for 5 days

圖9　材料降解15 d時纖維表面形貌觀察Fig.9　Morphologies of fibers after degradation for 15 days

3　結　論

本文采用天然絲素纖維和再生絲素長絲以管狀織物的結構形態構建人工韌帶，研究表明：采用CaCl2-FA溶解蠶絲可快速獲得再生絲素溶液，同時該溶液具有良好的可紡性，通過濕法紡絲技術能夠制備表面光滑且力學性能良好的再生絲素長絲。選擇天然絲素纖維編織層數為9層、編織角度控制在2θ=45°±2°、中間包裹400根再生絲素長絲構建絲素蛋白纖維人工韌帶，該韌帶材料的斷裂強力可達(1 942.6±7.5)N。從韌帶材料中纖維的表面形貌觀察發現，再生絲素長絲較天然絲素纖維有較快的降解速度。

[1]PETERSEN W, TILLMANN B. Anatomy and function of the anterior cruciate ligament[J]. Der Orthopade,2002,31(8):710-718.

[2]JAMISON S T, MCNALLY M P, SCHMITT L C, et al. The effects of core muscle activation on dynamic truck position and knee abduction moments: implication for ACL injury[J]. Journal of Biomechanics,2013,46(13):2236-2241.

[3]LEONG N L, FRANK F A, DAVID R M. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction[J]. Journal of Biomedical Materials Research: Part A,2014,102(5):1614-1624.

[4]ALTMAN G H, HORAN R L, LU H H, et al. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J]. Biomaterials,2002,23(20):4131-4141.

[5]LIU H F, LIU H B, SIEW L T, et al. A comparison of rabbit mesenchymal stem cells and anterior cruciate ligament fibroblasts responses on combined silk scaffolds[J]. Biomaterials,2008,29(10):1443-1353.

[6]COOPER J A, LU H H, KO F K, et al. Fiber-based tissue-engineered scaffold for ligament replacement: design considerations and in vitro evaluation[J]. Biomaterials,2005,26(13):1523-1532.

[7]LU Q, SIMIONESCU A, VYAVAHARE N. Novel capillary channel fiber scaffolds for guided tissue engineering[J]. Acta Biomaterialia,2005,1(6):607-614.

[8]IDE A, SAKANE M, CHEN G P, et al. Collagen hybridization with poly L-lactic acid braid promotes ligament cell migration[J]. Materials Science and Engineering C,2001,17(1):95-99.

[9]CHEN G P, SATO T, SAKANE M, et al. Application of PLGA-collagen hybridmesh for three-dimens ional culture of canine anterior cruciate ligament cells[J]. Materials Science and Engineering C,2004,24(6):861-866.

[10]NAU T, NLAVOIE P, DUVAL N. A new generation of artificial ligaments in reconstruction of the anterior cruciate ligament[J]. Journal of Bone and Joint Surgery,2002,84(3):356-360.

[11]WU H Y, ZHANG F, YUE X X, et al. Wet-spun silk fibroin scaffold with hierarchical structure for ligament tissue engineering[J]. Materials Letters,2014,135:63-66.

[12]YUE X X, ZHANG F, WU H Y, et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution[J]. Materials Letters,2014,128:175-178.

[13]吳惠英,左保齊,周燕.氯化鈣/甲酸溶解體系下氯化鈣質量分數對蠶絲溶解性的影響[J].紡織學報,2014,35(12):1-6.

WU H Y, ZUO B Q, ZHOU Y. Effect of CaCl2concentration on solubility of silk in CaCl2-formid acid system[J]. Journal of Textile Research,2014,35(12):1-6.

[14]JOSEPH W F, MIA D W, CATO T L. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design[J]. Journal of Biomechanics,2007,40:2029-2036.

Preparation of artificial ligament with silk fibroin and analysis of its property

WU Huiying1,2, ZHOU Yan1, ZUO Baoqi2,3

(1. School of Textile and Clothing and Arts and Media, Suzhou Institute of Trade & Commerce, Suzhou 215009, China;2. College of Textile & Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215123, China; 3. National Engineering Laboratory for Modern Silk, Suzhou 215123, China)

Silk fibroin has2-Formid Acid solution quickly to gain regenerated silk fibroin solution, and silk fibroin filaments with smooth surface and good mechanical property can be obtained by wet spinning technology. The breaking strength of ligament can reach (1 942.6±7.5)N under the following conditions: 9 layers of natural silk fibroin, angle 2θ=45°±2°, and 400 filaments as core yarns. The degradation tests demonstrate that regenerated silk fibroin filaments degrade faster than natural silk fibroin.

extensive attention as a choice for tissue engineering material because of its good biocompatibility. In this paper, composite silk fibroin ligament was constructed with natural silk fibroin and regenerated silk fibroin by using vertical spindle knitting machine. In the artificial ligament, regenerated silk fibroin filaments were braided as core yarns and natural silk fibroin was braided outside. The results indicate that at room temperature silk van be dissolved in CaCl

calcium chloride/formic acid; natural silk fibroin; regenerated silk fibroin filament; artificial ligament; property; degradation

10.3969/j.issn.1001-7003.2016.07.001

2015-09-21;

2016-06-02

國家繭絲綢發展專項資金資助項目(國繭協辦函〔2015〕32號)；江蘇省應用基礎研究計劃項目(BK2014 1207)；蘇州市應用基礎研究計劃項目(SYG201431)；中國紡織工業聯合會科技指導性項目(2015009)；蘇州經貿職業技術學院自然基金項目(KY-ZR1501)

TS102.33

A

1001-7003(2016)07-0001-06引用頁碼: 071101