嗜麥芽窄食單胞菌產氨基糖苷類修飾酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆與表達

關小珊，關銳梨，鐘華敏，鄧秋連，謝永強，周珍文

(廣州市婦女兒童醫療中心兒童院區檢驗科　510120)

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·論著·

嗜麥芽窄食單胞菌產氨基糖苷類修飾酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆與表達

關小珊，關銳梨，鐘華敏，鄧秋連，謝永強，周珍文△

(廣州市婦女兒童醫療中心兒童院區檢驗科510120)

目的對嗜麥芽窄食單胞菌臨床分離株gzch810(SM gzch810)攜帶的產氨基糖苷類修飾酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ進行擴增、測序及原核表達，為下一步功能試驗的開展提供基礎材料。方法提取SM gzch810基因組染色體，PCR擴增APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ全基因并克隆入pMD18-T載體進行核苷酸序列分析；將APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因克隆至表達載體pGEX-4T-1，轉化大腸桿菌BL21，SDS-PAGE分析融合蛋白表達情況。結果以染色體DNA為模板，成功擴增800 bp APH(3′′)-Ⅰ基因和550 bp AAC(2′)-Ⅰ基因；序列比對分析顯示其與相關報道序列核苷酸和氨基酸一致性分別達91%及95%；SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ序列已登錄GenBank(登錄號：HQ315852和HQ315853)；SDS-PAGE顯示，融合基因表達的蛋白相對分子質量分別約為56×103和46×103。結論從SM gzch810中成功克隆及表達了APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對相應抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準備。

嗜麥芽窄食單胞菌；產氨基糖苷類修飾酶基因；克隆；原核表達

嗜麥芽窄食單胞菌(SM)為醫院內獲得性感染的重要病原菌之一，中國CHINET監測網2013年度耐藥監測數據表明，該菌占所有革蘭陰性菌的3.96%，非發酵菌的10.82%[1]；國外文獻報道，SM引起肺部感染的歸因死亡率高達20%～30%[2]。SM耐藥機制復雜，對大多數抗菌藥物耐藥，是臨床抗感染治療中的一道難題，其中對β-內酰胺類、喹諾酮類藥物的耐藥機制已有較多研究，但對氨基糖苷類藥物的耐藥研究則較少。本文從臨床兒童先天性心臟病患者血液分離菌株gzch810中PCR擴增出APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因并將其在大腸桿菌中進行表達，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準備。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1SM gzch810分離株來源于2012年5月分離自本院CICU心臟病患者血液，患兒男性，日齡8 d。

1.1.2試劑與儀器pGEX-4T-1質粒載體購自法國馬西亞公司；pMD18-T質粒載體，Ex-Taq DNA聚合酶，EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶，T4 DNA連接酶等購自Takara公司。IPTG、丙烯酰胺、Tris堿、甘氨酸等購自鼎國公司。德國Biometra公司PCR儀，英國Uvitec公司GAS7508-T20紫外凝膠成像分析系統，德國 Sorvall公司Micro 17R臺式高速冷凍離心機。

1.2方法

1.2.1染色體DNA的提取及擴增根據GenBank提供的Smlt2336(YP001972129.1)和Smlt1669(YP001971501.1)序列，設計特異性引物兩對：APH(3′′)-Ⅰ P1：5′-CGC GAA TTC ATG AGC GAA CCC TAC CTG AG-3′，APH(3′′)-Ⅰ P2：5′-AAA CTC GAG TCA CTT CTC CGC CAG CGC CT-3′；AAC(2′)-Ⅰ P1：5′-CGC GAA TTC ATG GGC CTG GAC ACA CAT TCA-3′，AAC(2′)-Ⅰ P2：5′-AAA CTC GAG TCA GAC CGT TTC GCC CTG CA-3′，引物序列分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點。以試劑盒提取的染色體DNA為模板進行PCR擴增，反應條件為預變性94 ℃ 5 min后,94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min，循環35次，最后72 ℃延伸15 min。

1.2.2pMD18-T-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ的構建及序列分析PCR產物純化后與pMD18-T載體16 ℃連接2 h，連接產物轉化大腸桿菌DH5α。挑取經氨芐西林篩選的陽性菌落提取質粒并經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；將鑒定含目的基因的質粒菌送Invitrogen公司進行測序并將測序結果進行BLAST比對分析。

1.2.3pGEX-4T-1-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ的構建及表達純化PCR產物與pGEX-4T-1載體經EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后連接過夜,轉化大腸桿菌BL21；挑取經氨芐篩選的陽性菌落提取質粒并進行雙酶切鑒定。將含有重組質粒的BL21接種于含氨芐西林(100 μg/mL)的LB培養基，37 ℃培養過夜后挑單菌落于含氨芐西林LB液體培養基中振蕩培養至OD600值為0.4左右，加 IPTG至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃誘導表達5 h，8 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集菌體，SDS-PAGE電泳鑒定。

2　結　果

2.1pMD18-T-APH(3′′)-Ⅰ/AAC(2′)-Ⅰ重組質粒的測序結果測序結果顯示，SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ基因全長813 bp；預測的相對分子質量為30 113.43，等電點為5.85。其序列已登錄GenBank,登錄號為HQ315852，與SM K279a株氨基酸同源性達91%(圖1)。SM gzch810 AAC(2′)-Ⅰ基因全長549 bp；預測的相對分子質量為2 0183.02，等電點為5.96。其序列已登錄GenBank,登錄號為HQ315853，與SM K279a株氨基酸同源性達95%(圖2)。

圖1　SM gzch810 APH(3′′)-Ⅰ與SM K279a株氨基酸同源性比較

2.2SDS-PAGE檢測Smqnr蛋白的表達重組菌經IPTG誘導后可見GST和APH(3′′)-Ⅰ、AAC(2′)-Ⅰ的融合蛋白表達帶，相對分子質量分別約為56×103和46×103，含空質粒菌經誘導后則在26×103位置上出現GST表達帶(圖3、4)。

圖2　SM gzch810 AAC(2′)-Ⅰ與SM K279a株氨基酸同源性比較

注：Lane1為預染蛋白marker；lane2為pGEX-4T-1-APH(3′′)-Ⅰ/BL21經誘導；Lane3為pGEX-4T-1/BL21經誘導。

圖3重組蛋白表達產物SDS-PAGE電泳結果

注：Lane1為預染蛋白 marker；lane2為pGEX-4T-1-AAC(2′)-Ⅰ/BL21 經誘導；Lane3為pGEX-4T-1/BL21經誘導。

圖4重組蛋白表達產物SDS-PAGE電泳結果

3　討　論

SM是醫院內感染的重要致病菌之一，對氨基糖苷類藥物的耐藥機制主要有：(1)膜屏障的改變或主動外排作用使藥物的吸收減少；(2)核糖體結合位點的改變；(3)氨基糖苷類修飾酶(AMEs)對藥物的修飾鈍化作用，其中以AMEs的作用為主要原因。常見的AMEs 按功能可分為磷酸轉移酶(APH)、乙酰轉移酶(AAC) 和核苷轉移酶(ANT) 3類，已在美國NCBI登錄的AMEs基因有30余種[3]，目前在臨床分離革蘭陰性桿菌中，最常見的有AAC(3)-Ⅰ、AAC(3)-Ⅱ、AAC(6′)-Ⅰb、AAC(6′)-Ⅱ、ANT(2′′)-Ⅰ、ANT(3′′)-Ⅰ[4-5]共6種，但在SM中除AAC(6′)-Ⅰz[6]、APH(3′)-Ⅱc[7]外，僅有少量檢出ANT(2′′)-Ⅰ、AAC(6′)-Ⅱ 和AAC(3) -Ⅰ/Ⅱ[8-9]的報道。此類酶作用于氨基糖苷類抗菌藥物特定的氨基或羥基，使抗菌藥物發生鈍化，降低或喪失對靶位核糖體的親和力而不能進入下一階段發揮抗菌作用。由AMEs所致的耐藥性在不同的微生物或不同菌株之間有很大差異，取決于酶產生的數量、酶的催化活性和作用于何種抗菌藥物等因素；在眾多能產生足夠活性而使細菌達到耐藥標準的AMEs中，APHs能造成高水平耐藥[10]。

APH是一種利用ATP作為第二底物，且能磷酸化所有氨基糖苷類抗菌藥物的羥基酶。目前,臨床上分離到的APH有7種，其中APH(3′′)-Ⅰ的作用底物只有鏈霉素，修飾其3′′位羥基。本次實驗檢出的APH(3′′)-Ⅰ基因經核苷酸及氨基酸序列分析，與GenBank上登記注冊的Smlt 2336、Smlt 1923氨基酸同源性分別達到91%和89%，是國內首次從臨床分離SM中檢出APH(3′′)-Ⅰ基因，該基因序列已登錄GenBank，登錄號為HQ315852。SDS-PAGE結果顯示，在IPTG的誘導下，重組表達質粒表達出了相對分子質量約56×103的融合蛋白，與核苷酸序列推導的蛋白質分子量大小相符。

AAC 有4 種同工酶:AAC(1)、AAC(3)、AAC(2′)和AAC(6′)，主要以乙酰輔酶A作為乙酰基的供體,分別作用于氨基糖苷類抗菌藥物的2-脫氧鏈霉胺環的1位和3 位、6-氨基己糖環的2′位和6′位。AAC(6′)和AAC(3)多數由轉座子、整合子和質粒等可移動遺傳元件介導，在抗菌藥物的選擇壓力下能在微生物間迅速播散[11-12]，而目前所發現的AAC(2′)則均由染色體編碼。本次實驗檢出的AAC(2′)-Ⅰ基因經測序及同源性分析，與GenBank上登記注冊的Smlt 1669氨基酸同源性達95%，與從結核分枝桿菌中檢出的AAC(2′)-Ⅰc 同源性僅30%，推測其具種屬特異性，不同菌屬間不能傳播。

本實驗從臨床分離株 gzch810 中經PCR檢出兩種AMEs基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ，并對其進行了克隆及表達，為下一步檢測上述兩種重組體大腸桿菌對相應抗菌藥物的耐藥性及其功能評價做好準備。

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Clone and expression of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ gene of Stenotrophomonas maltophilia

GUAN Xiaoshan,GUAN Ruili，ZHONG Huamin,DENG Qiulian,XIE Yongqiang,ZHOU Zhenwen△

(GuangzhouMunicipalWomenandChildren′sMedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510120,China)

ObjectiveTo perform the amplification,sequencing and prokaryotic expression of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ genes from the clinically isolated gzch810 strain(SM gzch810)of Stenotrophomonas maltophilia to provide the basic materials for the next step functional test.MethodsThe SM gzch810 genome chromosome was extracted,the APH(3′′)-Ⅰ,AAC(2′)-Ⅰ whole genes were amplified by PCR and sequenced after being cloned into pMD18-T vector.The recombination were subcloned into pGEX-4T-1 vector and the expression of the recombinant APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ were analyzed by SDS-PAGE.ResultsThe 800bp and 550bp DNA fragments of APH(3′′)-Ⅰ,AAC(2′)-Ⅰ gene were amplified from SM gzch810 by PCR and sequenced;the sequence comparison analysis showed that DNA and amino acid sequence identities of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ genes with other strains were 91% and 95% respectively.The sequence of APH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰ of SM gzch810 were submitted to GenBank(accession number：HQ315852 and HQ315853);two major protein bands corresponding to the expected recombinant GST-TP fusion proteins (56×103and 46×103respectively) were identified by SDS-PAGE.ConclusionAPH(3′′)-Ⅰand AAC(2′)-Ⅰgene of SM gzch810 are successfully cloned and expressed,which lays a good foundation for further detecting corresponding antibiotic resistance and functional evaluation of above two kinds of recombinant E.coli.

Stenotrophomonas maltophilia;AMEs;clone;prokaryotic expression

2016-01-18修回日期：2016-05-05)

關小珊，女，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。△

，E-mail：zhouzhenwen28@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.018

A

1673-4130(2016)15-2099-03