免疫比濁法檢測血清游離輕鏈的方法學評價*

陳建平，楊曙梅，丁　燁，王惠民，鞠少卿，叢　輝△

(1.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛生學院醫學檢驗系，江蘇南通 226019)

?

·論著·

免疫比濁法檢測血清游離輕鏈的方法學評價*

陳建平1，楊曙梅1，丁燁2，王惠民1，鞠少卿1，叢輝1△

(1.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛生學院醫學檢驗系，江蘇南通 226019)

目的對Beckman Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測血清游離κ、λ輕鏈(sFLC)進行方法學評價。方法通過Beckman Immage 800定量測定sFLC，探討其精密度、正確度、分析測量范圍、干擾和攜帶污染率，同時對其參考區間進行驗證。結果κFLC低、高值批內精密度的變異系數(CV)分別為7.84%、2.95%，批間精密度的CV分別為7.38%、5.57%；λFLC低、高值批內精密度(CV)分別為4.59%、3.94%，批間精密度CV分別為3.97%、2.01%；測定κFLC、λFLC定值質控血清與靶值的偏倚小于5%；κFLC、λFLC分析測量范圍分別為10.8～128.0 mg/L、10.1～121.0 mg/L時，a值在0.95～1.05，r2≥0.98；κFLC、λFLC攜帶污染率分別為0.411%、0.216%；干擾試驗結果顯示游離膽紅素≤342.0 μmol/L、結合膽紅素≤342.0 μmol/L、血紅蛋白≤5 g/L和乳糜≤2 400濁度時，對sFLC結果無明顯影響；40例健康體檢者中有1例κFLC測定結果超出廠家推薦的參考區間，40例λFLC檢測值均在廠家推薦的參考區間內。結論Beckman Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測sFLC的主要分析性能符合質量目標的要求，能夠為臨床提供科學、準確的診療依據。

全自動特種蛋白分析儀；方法學評價；血清游離輕鏈

血清游離輕鏈(sFLC)包含游離κ、λ輕鏈，是判斷患者體內是否存在克隆性漿細胞的高度敏感指標。定量檢測sFLC以及計算游離κ/λ的比值有助于多發性骨髓瘤(MM)、原發性淀粉樣變(AL)、未定性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)等疾病的診斷、療效判斷及預后評估[1]。血清κ、λ輕鏈和免疫固定電泳在一定程度上有助于MM的診斷，但均有一定的方法學局限性，如血清輕鏈測定的是血清中總輕鏈量，敏感性差；免疫固定電泳的敏感度也僅有150～500 mg/L，從而易致患者的漏診。2006年，國際骨髓瘤協作組(IMWG)將患者sFLC水平引入MM的評定標準中，作為完全緩解(sCR)的療效分類標準，確立了sFLC定量檢測在臨床應用中的地位和價值[2]。近年來，sFLC的檢測得到了國內越來越多臨床醫生的重視和患者的高度關注[3]。目前，我國臨床實驗室測定sFLC主要采用免疫比濁法，關于Beckman Immage 800全自動特種蛋白儀測定sFLC方法學評價的文獻較少見。本次試驗參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)的相關文件及文獻，探討了Beckman Immage 800散射比濁法檢測sFLC的方法學評價。

1　材料與方法

1.1一般資料選取2015年1～10月南通大學附屬醫院門診和病房多發性骨髓瘤確診患者40例及體檢中心健康體檢者血清40例。靜脈抽血5 mL，4 000 r/min離心10 min，分離血清備用。

1.2儀器與試劑美國Beckman Coulter Immage 800全自動特種蛋白分析儀；英國Binding Site公司FreeliteTM血清游離輕鏈檢測試劑盒(κFLC批號344785G，λFLC批號349269A)；FreeliteTMsFLC配套校準品(κFLC批號344965，λFLC批號347207)；FreeliteTMsFLC配套質控品(κFLC批號351843，λFLC批號347208)；日本Sysmex A-Plus干擾試劑盒(批號ZS1001)。

1.3方法

1.3.1建立sFLC比濁法測定法根據FreeliteTMsFLC說明書設置儀器參數：標本量5 μL，Buffer 195 μL，稀釋倍數1∶10。6點校準，每個濃度校準品重復測定兩次。

1.3.3正確度評價參照NCCLS EP15-A[5]，按照檢測定值的參考物質計算偏差進行驗證：測定高、低兩個水平質控品，每天測定2次，連續測定5 d，計算10次檢測結果均值，將各自檢測結果與靶值進行對比，計算檢測值與靶值的相對偏倚(%)，計算公式：偏倚=(測定值-靶值)/靶值×100%。

1.3.4分析測量范圍評價參照NCCLS EP6-A[6]文件，分別選擇sFLC含量接近廠家線性范圍上限的新鮮血清標本1份作為高值濃度水平(H：κFLC 128.0 mg/L，λFLC 121.0 mg/L)，sFLC含量低的健康體檢者血清作為低值濃度水平(L:κFLC 10.8 mg/L，λFLC 10.1 mg/L)1份，按照5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L的關系分別配制6個濃度梯度，對各濃度水平進行sFLC測定，各濃度重復測定4次，對測定結果的均值和理論值進行線性回歸統計，計算回歸方程：Y=aX+b，進行分析測量范圍評價。a值應在1±0.05范圍內，相關系數(r2)≥0.950。

1.3.5攜帶污染率評價參考文獻[7]，分別選取高水平FLCs新鮮血清標本連續測定3次，測定值分別為H1、H2、H3；再分別選取低水平sFLC新鮮血清標本連續測定3次，測定值分別為L1、L2、L3，計算攜帶污染率。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。攜帶污染率應≤2.0%。

1.3.7參考區間驗證參照NCCLS C28-A2[9]文件選取2015年8月南通大學附屬醫院體檢中心健康體檢者40例。健康參考個體選擇標準：(1)男、女各20例，年齡20～60歲，無吸煙、飲酒，自覺健康者；(2)無急慢性感染、呼吸系統疾病、過敏性疾病、肝膽管疾病、血液性疾病、腎臟疾病、風濕性疾病、血管病和高血壓；(3)近期未手術、輸血、大量失血和服用藥物；(4)無慢性理化損傷或接觸化學損傷。測定sFLC，將檢測結果與參考區間比較(廠家參考區間：κFLC 3.30～19.40 mg/L；λFLC 5.71～26.30 mg/L)。檢測結果若超出參考區間的數據不超過10%，則通過驗證，以判定廠家提供的生物參考區間有效。

表1　4種干擾物各管濃度表

1.4統計學處理采用Microsoft Excel 2003軟件對精密度試驗、特異性試驗數據進行統計及Origin75統計軟件對分析測量范圍數據進行回歸分析。

2　結　果

2.1sFLC精密度評價結果分別用低、高兩個濃度血清做批內和批間精密度評價，κFLC低、高濃度血清批內CV分別為7.84%、2.95%，批間CV分別為7.38%、5.58%；λFLC低、高濃度血清批內CV分別為4.59%、3.94%，批間CV分別為4.00%、2.01%，見表2。

表2　sFLC批內精密度

2.2sFLC正確度評價結果κ、λFLC正確度驗證結果見表3，κFLC相對偏倚分別為3.01%、-3.81%，λFLC相對偏倚分別為2.28%、-4.58%，結果均低于廠家說明書的偏倚值，正確度滿足要求。見表3。

表3　sFLC準確度評價試驗

2.3sFLC分析測量范圍評價結果分別測量sFLC 6個濃度混合血清，計算均值，將測定均值與理論預期值比較，偏倚均小于10%；同時將測定均值與理論值進行線性回歸分析，本系統κFLC測定范圍在10.8～128.0 mg/L，λFLC測定在10.1～121.0 mg/L呈線性。κFLC回歸方程及相關系數的平方為：Y=1.0441X-4.0789，r2=0.986；λFLC回歸方程及相關系數的平方為：Y=0.9887X+1.2471，r2=0.999，滿足判斷要求，散點圖見圖1、2。

圖1　κFLC線性回歸分析

圖2　λFLC線性回歸分析

2.4sFLC攜帶污染率評價κFLC的H1、H2、H3分別為117.0、118.0、119.0 mg/L；L1、L2、L3分別為9.52、8.76、9.07 mg/L，計算攜帶污染率為0.411%。λFLC的H1、H2、H3分別為119.0、118.0、114.0 mg/L；L1、L2、L3分別為21.9、22.6、21.7 mg/L，計算攜帶污染率為0.216%。FLCs攜帶污染率均小于2%。

2.5sFLC特異性評價BU≤342.0 μmol/L、BC≤342.0 μmol/L、Hb≤5 g/L、乳糜物≤2 400濁度時，對κ和λFLC的測定基本無影響，干擾值均在空白組1.96s范圍內。

2.6sFLC參考區間驗證40例健康體檢者κFLC測定結果有1例觀察值為3.18 mg/L，在廠商提供的參考區間3.30～19.40 mg/L外；λFLC測定結果介于5.71～26.30 mg/L。在參考區間外的數據未超過10%，表明廠家提供的95%參考區間可以接受。

3　討　論

Immage 800全自動特種蛋白分析儀方法學原理為免疫比濁法，有著較高的靈敏度和特異性。為了保證臨床實驗室檢驗質量，根據國家醫學實驗室認可(ISO15189)和美國病理學家協會(CAP)對臨床實驗室質量管理的要求[10]和臨床實驗室認可的要求[11]，臨床實驗室在新的檢驗方法用于檢測常規患者標本、儀器重要維修或試劑更換生產廠家前必須對檢測系統的分析性能進行評價，確認檢測系統的分析性能符合臨床要求方可使用[12]。為了證實Immage 800全自動特種蛋白分析儀檢測sFLC分析性能的可靠性，本次試驗參考CLSI EP文件資料對Immage 800檢測sFLC進行初步的分析性能評價，評價了本法的精密度、分析測量范圍、攜帶污染率、特異性，同時還對sFLC參考區間進行了驗證。

臨床標本結果與真值間的偏離主要有不精密度、正確度、干擾。精密度是多次重復測量同一量時各測量值之間彼此符合的程度，表示測量過程中隨機誤差的大小。其是檢測系統主要的分析性能之一，是進行其他性能評價的基礎[13]。臨床檢測系統精密度的評價通常參考NCCLS EP5-A2文件評價方案，該方案是目前最具有統計效能的一種精密度評價方法。本次試驗結果顯示，κFLC低、高兩個水平批內不精密度分別是7.84%和2.95%；批間不精密度分別是7.38%和5.58%。λFLC低、高兩個水平批內不精密度分別是4.59%和3.94%；批間不精密度分別是4.00%和2.01%。結果表明本法檢測sFLC精密度性能高，達到CLIA′88允許誤差的1/3水平(允許不精密度<8.33%)。

在NCCLS EP9-A文件中，正確度驗證方法是使用臨床患者標本進行方法學比較和偏倚估計，這種方法需要對照，對于實驗室新開展的檢測項目來說存在一定的困難。因此，本次試驗在進行sFLC正確度評價時，參照了NCCLS EP15-A文件的評價方案，采取使用有定值的參考物質來計算偏倚的方法來進行檢測系統的正確度評價。試驗結果分析發現κ、λFLC檢測均值與質控的相對偏倚均小于5.0%，偏倚水平低于廠家說明書的偏倚允許范圍，符合要求，說明本檢測系統對sFLC濃度檢測的正確度高。

分析測量范圍即定量檢測項目的線性范圍，是分析方法的一個重要技術指標，是判斷檢測系統測得的濃度與實際濃度是否呈線性的性能。分析測量范圍評價反映了整個檢測系統的輸出特性，有助于了解檢測結果的準確性和可靠性。NCCLS EP6-A文件要求對分析測量范圍評價時需要5～7個濃度，每個濃度至少測定2次。在本次試驗中選擇了6個濃度標本，每個標本檢測4次，對檢測系統進行分析測量范圍驗證。結果表明κFLC和λFLC均表現出較好的線性，a值和r2均滿足要求，符合臨床檢驗的要求。廠家說明書給予的κFLC線性范圍是6.0～180.0 mg/L、λFLC線性范圍是4.8～162.0 mg/L，本次試驗中由于κFLC和λFLC的高值標本一時無法獲得，因此κFLC和λFLC高值標本稍低于最高檢測值，還需要后期補充驗證。

攜帶污染是連續測量不同濃度標本間的相互影響，主要是高濃度標本對后續檢測標本的影響。影響標本攜帶污染率的因素主要是清洗劑的清洗能力、清洗劑用量、清洗次數、清洗溫度等。攜帶污染率是檢測結果準確的必要條件，是評價檢測系統的關鍵指標，攜帶污染率越低表明檢測結果越準確。試驗結果顯示κFLC、λFLC攜帶污染率分別是0.411%、0.216%，均小于判斷要求，表明檢測系統攜帶污染率低，能夠適應實驗室常規臨床標本的檢測要求。

在EP7-A2文件中提供了兩種實驗方案進行干擾試驗評價：(1)干擾篩選；(2)利用患者標本作偏倚分析。由于第2種評價方法需要高特異性的比較方法，本實驗室難以滿足其要求。因此，本次試驗采用第1種方案，即將潛在干擾物添加到標本中來評價干擾性。將血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素3種常見的物質作為干擾源對sFLC檢測結果進行特異性分析。試驗結果表明膽紅素、血紅蛋白、三酰甘油對κFLC及λFLC的測定影響較小，表明該檢測系統檢測sFLC的抗黃疸、溶血、脂血的能力較強。臨床標本的質量對免疫比濁法檢驗的干擾需要臨床檢驗者的重視，因此在臨床標本sFLC檢測結果報告時最好將反映溶血、脂血及黃疸程度的指數一并報告臨床醫生，使檢驗結果更嚴謹、可靠。

參考區間是臨床判斷健康與否的尺標，

合適的參考區間對疾病的預防、診斷、療效評價及預后有著重要的意義[14]。本次試驗中對廠家提供的sFLC參考區間進行了驗證。廠家提供的κFLC參考范圍是3.30～19.40 mg/L、λFLC參考范圍是5.71～26.30 mg/L。通過對40例健康體檢者進行sFLC檢測分析，結果表明廠商提供的sFLC參考區間適用于本地區、本實驗室使用。

本次研究結果表明，在Immage 800全自動特種蛋白分析儀上測定sFLC的方法精密度高，正確度高，線性良好，攜帶污染率低，抗干擾能力強。

綜上所述，Immage 800檢測sFLC的主要分析性能符合臨床質量管理目標的要求，是一種簡便、快捷、準確、可靠的臨床檢測方法，能夠為臨床醫生在疾病的診療過程中提供可信的實驗室依據。

[1]Katzmann JA,Willrich MA,Kohlhagen MC,et al.Monitoring IgA multiple myeloma:immunoglobulin heavy/light chain assays[J].Clin Chem,2015,61(2):360-367.

[2]Duri E,Harousseau JL,Miguel JS,et al.International uniform response criteria for multiple myeloma[J].Leukemia,2006,20:2220-2226.

[3]陳耐飛，崔久嵬，姚迪，等．血清游離輕鏈檢測在多發性骨髓瘤診治中作用的臨床評價[J]．臨床血液學雜志，2012，25(6)：703-705．

[4]NCCLS.Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods.Approved gudelinesecond edition：EP5-A2[S].Wayne，PA，USA:NCCLS,2004.

[5]NCCLS.User demonstration of performance for precision and accuracy.Approved guideline：EP15-A[S].Wayne，PA，USA:NCCLS,2001.

[6]NCCLS.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures.Statistical approved guideline：EP6-A[S].Wayne，PA，USA:NCCLS,2003.

[7]普程偉，尚柯，王建中，等．UniCel DxH 800血細胞分析儀臨床應用評價[J]．中華檢驗醫學雜志，2012，35(7)：643-646．

[8]CLSI.Interference testing in clinical chemistry：EP7-A2[S].Wayne，PA，USA:CLSI,2005.

[9]NCCLS.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory;approved guideline-second edition：C28-A2 [S].Wayne，PA，USA:NCCLS,2000.

[10]College of American Pathologists.Clinical Immunology Checklist [R].Northfield:CAP,2006:1-21.

[11]叢玉隆，馮仁豐，陳曉東．臨床實驗室管理[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2004：72-73．

[12]趙建忠．生化分析儀精密度、準確性以及線性范圍性能驗證[J]．國際檢驗醫學雜志，2011，32(10)：1111-1112．

[13]蔣紅君，蔣杰，王凡．全自動生化分析儀的檢測精密度、正確度評價及參考區間的驗證[J]．國際檢驗醫學雜志，2013，34(9)：1147-1148．

[14]馮仁豐．臨床檢驗質量管理技術基礎[M]．上海：上海科學技術文獻出版社，2003：1-136．

Methodological evaluation on serum free light chains detected by immunoturbidimetry*

CHEN Jianping1,YANG Shumei1,DING Ye2,WANG Huimin1,JU Shaoqing1，CONG Hui1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001，China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine，SchoolofPublicHealth，NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226019，China)

ObjectiveTo perform the methodological evaluation on Beckman Immage 800 automatic special protein analyzer for determining serum freeκ,λ light chains (sFLC).MethodsThe Beckman Immage800 automatic special protein analyzer was used to quantitatively detect sFLC values for investigating its precision and accuracy,analyzing its detecting range,interference and residual contamination rate,meanwhile verifying its reference intervals.ResultsThe low and high values of within-run precision coefficients of variation(CV) for κsFLC were 7.84% and 2.95% respectively;which of between-run precisionCVwere 7.38% and 5.57% respectively.The within-run precisionCVfor λFLC were 4.59% and 3.94% respectively,which of between-run precisionCVwere 3.97% and 2.01% respectively;bias for detecting the κFLC and λFLC fixed quality serum and the target values was less than 5%,when the analytical detection ranges of κFLC and λFLC were 10.8-128.0 mg/L and 10.1-121.0 mg/L,a value was 0.95-1.05，r2≥0.98;the carry-over rates of κFLC and λFLC were 0.411% and 0.216% respectively.The interference test results showed that when free hemoglobin≤342.0 μmol/L,conjugated bilirubin ≤342.0 μmol/L,hemoglobin≤5 g/L and chyle ≤2 400 turbidness,which had no influence on sFLC results;among 40 healthy subjects undergoing the physical examination,1 case of κFLC detection results exceeded the reference interval recommended by the manufacturer,while the λFLC detection values in these 40 cases were all within the reference interval recommended by the manufacturer.ConclusionThe main analytical performance of the Beckman Immage800 automatic special protein analyzer for detecting sFLC meets the requirements of quality objectives and can provides the scientific and precise evidence of diagnosis and treatment for clinic.

full automatic special protein analyzer；methodology evaluation；serum free light chains

2016-01-25修回日期：2016-05-04)

江蘇省衛生廳項目(H201526)；江蘇省“六大人才高峰”基金項目(WS-066)。

陳建平，女，主管檢驗技師，從事臨床免疫檢驗工作。△

，E-mail:huicjs@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.004

A

1673-4130(2016)15-2058-03