人參皂苷Rg1促進坐骨神經損傷后修復的研究

馮慧瓊　董　峰.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內一科，內蒙古包頭　0400；.包鋼集團第三職工醫院骨科，內蒙古包頭　0400

人參皂苷Rg1促進坐骨神經損傷后修復的研究

馮慧瓊1董峰2
1.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內一科，內蒙古包頭014010；2.包鋼集團第三職工醫院骨科，內蒙古包頭014010

目的觀察中藥人參皂苷Rg1（GsRg1）對大鼠坐骨神經損傷后是否有促進神經功能恢復的作用。方法離斷大鼠右側坐骨神經后，立即在顯微鏡下縫合，左側坐骨神經為空白對照，手術后，大鼠隨機分為生理鹽水組、GsRg1 2 mg、4 mg、8 mg、12 mg組和甲鈷胺組，分別腹腔內注射，手術2、4、8周后，通過測定坐骨神經功能指數（SFI），神經電生理方法檢測運動神經傳導速度（MNCV），據此評價坐骨神經再生和功能恢復情況。結果 SFI檢測示各組神經功能指數恢復明顯高于生理鹽水組，甲鈷胺組與GsRg1 2 mg、12 mg組相比神經功能指數恢復無明顯差異，GsRg1 4 mg、8 mg組神經功能指數恢復明顯高于GsRg1其他倆組及甲鈷胺組。神經傳導速度測定是各GsRg1劑量組及甲鈷胺組也明顯高于生理鹽水組，GsRg1組中4 mg組、8 mg組高于GsRg1其他2組及甲鈷胺組，GsRg1 2 mg組、12 mg組與甲鈷胺組神經傳導速度恢復相似。結論 GsRg1可以促進神經再生和功能恢復，且最佳用藥劑量為（4～8）mg/kg。

人參皂苷Rg1；坐骨神經；神經損傷；神經再生

從中醫角度看人參具有補氣固脫、寧心益智、養血生津、補脾益肺、大補元氣之功效。從西醫角度看，人參具有調節中樞神經系統、改善心肌功能、增加機體免疫功能、調節血糖、抗腫瘤、抗氧化等作用，李君慶等［1］通過對人參皂苷Rg1抗神經細胞凋亡作用機制的研究發現人參皂苷Rg1抗神經元凋亡是通過抑制DNA的斷裂而發揮的作用。曾有文獻報道，Schwann細胞能夠促進周圍神經的損傷修復，同時研究表明人參皂苷單體Rg1可促進Schwann細胞的分裂增殖及遷移［2］。張志軍等［3］研究表明人參皂苷單體Rg1促進周圍神經的損傷修復是通過影響內皮細胞的血管擴張及直接作用而完成的。上述資料進一步支持人參皂苷單體Rg1可促進周圍神經的再生。本研究進一步明確人參皂苷Rg1是否能夠促進離斷后縫合的坐骨神經功能恢復。

1　資料與方法

1.1動物來源

同種雄性大鼠體重（275±25）g，所有動物及飼料均購自內蒙古大學動物實驗中心，實驗動物的許可證號為：SCXK（蒙）2002-0001，購回的大鼠先進行適應性飼養5～7 d。根據內蒙古相關要求飼養。

1.2實驗藥物

人參皂苷Rg1由吉林大學生化教研室提供。甲鈷胺（瑞陽制藥有限公司，國藥準字H20050352），規格為0.5 mg。

1.3分組及方法

每只大鼠行右側坐骨神經離斷后纖維吻合，隨機分為6組，每組45只。4個實驗組分別以2 mg/（kg·d），4 mg/（kg·d），8 mg/（kg·d）和12 mg/（kg·d）腹腔注射人參皂苷Rg1，陽性對照組腹腔注射100 mg/（kg·d）甲鈷胺（Mecobalamin），陰性對照組注射生理鹽水，均連續給藥8周。每只大鼠右側為損傷側，左側為正常對照。配置相關試驗溶液。大鼠坐骨神經損傷模型的建立：成年雄性Wistar大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg），達到麻醉要求后，俯臥位固定大鼠、脫毛、消毒手術視野，在無菌條件下于右下肢股后部做一縱切口，長約1.5 cm，手術顯微鏡下無菌分離大腿的各肌層，充分顯露并游離坐骨神經，后在梨狀肌下緣0.8 cm處將坐骨神經離斷，隨即用無菌11-0無創傷尼龍線縫合，神經外膜處縫合4針，顯微縫線留置于該損傷區外膜上作為標記，然后用無菌1-0線逐層關閉切口。所有操作均由一人完成。術后觀察動物清醒后，分籠飼養，勤換墊料以防止足底潰瘍發生。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠足蹤分析和SFI術后2、4及8周進行蹤足分析和SFI（坐骨神經功能指數測定）測定。參考文獻報道方法［4］，制做長60 cm三棱柱形大鼠足印走行記錄暗箱，箱底鋪設白紙，足底蘸墨汁白鼠通過后于白紙上留下足跡。收足印，測量從足跟到足尖的距離作為足印長度（PL）、從第1～5趾的距離作為大鼠足趾寬度（TS）、從第2～4趾的距離作為中間足趾距離（ITS），精確至毫米。將變量帶入Bain公式計算SFI。SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3 （EITS-NITS）/NITS-8.8。實驗側大鼠的足印用EPL表示；正常側用NPL表示。實驗側足趾寬度用ETS表示；正常側用NTS表示。實驗側中間足趾距離用EITS表示；正常側用NITS表示。檢測后SFI以-100代表神經完全離斷，-11～-100表示部分神經功能恢復，0～±11表示神經功能完全正常。

1.4.2測定大鼠神經傳導速度用藥后于2、4及8周再次麻醉動物。暴露坐骨神經吻合口遠、近端及吻合口。BL-420 F電生理儀取坐骨神經檢測并記錄神經平均傳導速度，記錄最大波幅值等數據。

1.5統計學方法

將完整的臨床資料和實驗數據均輸入計算機，運用統計軟件包SPSS17.0進行處理，計量資料均以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠足蹤分析和坐骨神經功能指數測定

于術后第2周、4周及8周時進行大鼠雙側后足進行測量，統計數據后結果見表1。各組大鼠右后肢均跛行，術后各組大鼠的傷口愈合良好，無感染及動物死亡。大鼠表現為術側踝關節喪失功能，踝下垂，趾屈曲。行走時表現為膝關節以下觸地。通過觀察發現甲鈷胺組及人參皂苷劑量組的大鼠精神狀態均優于生理鹽水組。術后4周時行走狀態有所改善，但仍與對照側相比有差異。8周時各組動物狀態恢復較好，動作明顯優于生理鹽水對照組。

結果可見：方差分析的結果顯示處理之間（F= 1139.47，P＜1.93×10-5）和時間點之間（F=81.21，P＜6.56×10-7）的差異是極顯著的。同時同一時間點不同處理的差異結果如下（以第8周為例）：（1）各時間點甲鈷胺組及人參皂苷各組統計學上顯著優于生理鹽水組。各組與生理鹽水組的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-37.45，P＜3.33×10-3）；Gs 2 mg組：（t=-43.28，P＜2.11×10-2）；Gs 4 mg組：（t=-51.73，P＜5.80×10-6）；Gs 8 mg組：（t=-73.41，P＜4.90×10-6）；Gs 12 mg組：（t=-32.39，P＜5.60×10-6）。（2）4 mg及8 mg人參皂苷劑量組均優于甲鈷胺、2 mg及12 mg實驗組4 mg與甲鈷胺、2 mg及12 mg的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-17.48，P＜3.15×10-3）；Gs 2 mg組：（t=-24.18，P＜6.12×10-4）；Gs 12 mg組：（t=-17.60，P＜7.34×10-3）。（3）8 mg與甲鈷胺、2 mg及12 mg的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-25.22，P＜3.15×10-4）；Gs 2 mg組：（t=-48.90，P＜6.85×10-6）；Gs 12 mg組：（t=-22.86，P＜4.44×10-3）。（4）4 mg組與8 mg組差異無統計學意義（t=0.83，P＞7.79×10-1）。2 mg、12 mg及甲鈷胺三組間差異無統計學意義。三者之間差異顯著性檢驗結果分別為：2 mg-甲鈷胺：（t=1.08，P＞1.14×10-1）；12 mg-甲鈷胺：（t=-0.23，P＞4.09×10-1）；2 mg-12 mg：（t=-1.56，P＞6.11×10-1）。見表1。

表1　各組不同時間段SFI指數比較（）

表1　各組不同時間段SFI指數比較（）

組別　n　2周　4周　8周生理鹽水組甲鈷胺Gs 2 mg組Gs 4 mg組Gs 8 mg組Gs 12 mg組45 45 45 45 45 45 -90.52±3.12 -55.24±3.04 -57.23±2.30 -38.45±2.48 -39.45±2.32 -54.08±2.57 -83.30±5.49 -51.37±4.23 -53.51±1.47 -33.69±3.30 -34.18±3.44 -50.56±4.02 -81.17±4.23 -48.51±4.03 -50.73±2.09 -31.89±4.79 -32.51±1.37 -49.88±4.91

表2　各時間段坐骨神經平均傳導速度比較（n=45，，m/s）

表2　各時間段坐骨神經平均傳導速度比較（n=45，，m/s）

組別　2周　4周　8周生理鹽水組甲鈷胺組Gs 2 mg組Gs 4 mg組Gs 8 mg組Gs 12 mg組11.13±1.87 20.96±2.65 20.35±1.85 32.44±2.58 33.60±3.05 21.34±1.47 14.58±4.01 25.17±6.02 26.33±5.34 38.53±4.56 36.52±1.44 37.87±4.32 26.64±5.32 36.43±6.12 35.62±7.01 49.65±6.09 48.43±5.87 35.63±5.16

2.2測定神經傳導速度

手術后我們對人參皂苷劑量組、甲鈷胺組及生理鹽水組2、4、8周時的神經平均傳導速度進行檢測，見表2。甲鈷胺組及人參皂苷各劑量組各時間點神經平均傳導速度值均顯著優于對照組（P＜0.01），4 mg及8 mg人參皂苷劑量組均優于其他3個實驗組 （P＜0.05）。此外，人參皂苷劑量組4 mg組與8 mg組兩組間差異比較無統計學意義（P＞0.05），人參皂苷劑量組2 mg、12 mg及甲鈷胺三組間相互比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

結果可見：方差分析的結果顯示處理之間（F= 22.90，P＜3.53×10-5）和時間點之間（F=37.62，P＜2.22×10-5）的差異是極顯著的。同時我們研究了同一時間點，不同處理的差異。結果如下（以第8周為例）：（1）各時間點甲鈷胺組及人參皂苷各組統計學上顯著優于生理鹽水組。各組與生理鹽水組的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-23.12，P＜1.68×10-3）；Gs 2 mg組：（t=-18.35，P＜3.01×10-2）；Gs 4 mg組：（t=-23.56，P＜3.32×10-6）；Gs 8 mg組：（t=-52.12，P＜3.21×10-6）；Gs 12 mg組：（t=-28.56，P＜3.21×10-6）。（2）4 mg及8 mg人參皂苷劑量組均優于甲鈷胺、2 mg及12 mg實驗組。4 mg與甲鈷胺、2 mg及12 mg的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-12.38，P＜1.26×10-3）；Gs 2 mg組：（t=-23.15，P＜3.21×10-4）；Gs 12 mg組：（t=-11.23，P＜6.23×10-3）。8 mg與甲鈷胺、2 mg及12 mg的差異顯著性檢驗結果分別為：甲鈷胺組：（t=-20.36，P＜2.51×10-4）；Gs 2 mg組：（t=-52.30，P＜3.26×10-6）；Gs 12 mg組：（t=-18.54，P＜2.13×10-3）。（3）4 mg組與8 mg組兩組間差異比較無統計學意義（t=1.23，P＞6.39×10-1）。（4）2 mg、12 mg及甲鈷胺三組間相互比較差異無統計學意義。三者之間差異顯著性檢驗結果分別為：2 mg-甲鈷胺：（t=2.36，P＞1.32×10-1）；12 mg-甲鈷胺：（t=-1.25，P＞3.21×10-1）；2 mg-12 mg：（t=-1.52，P＞3.28× 10-1）。

3　討論

在臨床工作中坐骨神經損傷較為常見，坐骨神經損傷發病率高，并發癥多，致殘率高。關于實驗動物模型的選擇，我們在前期實驗進行的坐骨神經損傷模型的基礎之上，已經掌握了豐富的經驗，經過足蹤分析及其他方面檢測，證明利用坐骨神經離斷后再于顯微鏡下縫合，這一手術操作方法簡便易行，手術費用低，能較好的反映出坐骨神經損傷的模型［5］。與國內大部分實驗的模型選擇一致，能夠代表坐骨神經損傷后的實驗動物特性。另外在足蹤分析方面，結合實際我們自制的大鼠足印采集設備，能夠清晰的采集到大鼠后足的損傷側與正常側的圖像，便于數據收集。人參皂苷Rg1是其中最為重要的單體之一，藥理學作用相當廣泛，尤其是人參皂苷Rg1的神經保護和營養作用更是受到關注。人參皂苷是人參生理活性的物質基礎，由于烯酸的作用，在分離甙元時分子側鏈部分的羥基及烯鍵環合成人參二醇和人參三醇，均屬于三萜類皂苷。本文結合臨床及基礎的最新研究，從周圍神經損傷的治療方面，以動物實驗研究為主，對于大鼠的人參皂苷Rg1的劑量選擇，我們參考其他國內的實驗［6-15］，分別選擇2 mg，4 mg，8 mg，12 mg的劑量，便于藥理學的分析，通過對大鼠足蹤分析和坐骨神經功能指數測定，我們得出各時間點甲鈷胺組及人參皂苷各組統計學上顯著優于生理鹽水組 （P＜0.01），4 mg及8 mg人參皂苷劑量組均優于甲鈷胺、2 mg及12 mg實驗組（P＜0.05）。4 mg組與8 mg組兩組間差異比較無統計學意義（P＞0.05），2 mg、12 mg及甲鈷胺三組間相互比較差異無統計學意義（P＞0.05）。通過對術后2、4、8周各組別運動神經傳導速度測定，我們得出各時間點運動神經傳導速度值在統計學上實驗各組均顯著優于對照組（P＜0.01），4 mg及8 mg人參皂苷劑量組均優于其他3個實驗組（P＜0.05）。此外，4 mg組與8 mg組兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），2 mg、12 mg及甲鈷胺三組間相互比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。對周圍神經中人參皂苷發揮作用的機制的研究還尚未見報道，結合本研究，我們認為，隨著生物學技術的發展及藥理學的發展，對于人參皂苷對周圍神經的營養作用也會逐漸增多，促進周圍神經生長、神經功能恢復的藥物的探索的報道也會越來越多。這也將會是我們下一步的研究方向。

本課題創新性為在前期研究的基礎上，采用大鼠坐骨神經建立動物實驗模型，首次在體內系統地研究周圍神經離斷損傷并吻合術后，人參皂苷單體Rg1促進損傷神經再生和功能恢復的作用及其劑量效應關系、最佳有效治療劑量和毒性劑量；同時探究其對損傷神經相關神經元存活、死亡和相關生物分子的影響，以及對Schwann細胞凋亡、增值和分泌功能的作用，進而闡明其作用機制。

綜上所述，GsRg1可以促進神經再生和功能恢復，GsRg1促神經再生作用的最佳用藥劑量為（4～8）mg/kg。

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The experimental study on mechanism underlying the promoted regeneration of injured sciatic nerve by ginsenoside Rg1

FENG Huiqiong1DONG Feng2
1.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou014010，China；2.Department of Orthopaedics，Inner Mongolia Baotou Steel Group，the Third Worker Hospital，Baotou014010，China

Objective To observe the effect of Rg1 in rats whether the role of promoting neurological recovery after sciatic nerve injury.Methods After amputating the right sciatic nerve of rats we stitched it up immediately under the surgical microscope，leaving the left side sciatic nerve as the blank.After surgery，rats were randomLy divided into normal saline group，GsRg1 2 mg，4 mg，8 mg，12 mg group and methyl cobalamin group，respectively intraperitoneal injection，4 and 8 weeks after surgery，by measuring the sciatic functional index（SFI），neurophysiological method for detecting motor nerve conduction velocity（MNCV），whereby evaluation of sciatic nerve regeneration and functional recovery. Results SFI detect nerve function index showed recovery in each group were significantly higher than saline group phase，mecobalamine group restore nerve function index had no significant difference compared with GsRg1 2 mg，12 mg group，GsRg1 4mg，8mg group restore nerve function index was significantly higher in the other two groups and GsRg1 methylcobalamin group.Nerve conduction velocity:Each dose group of GsRg1 and Mecobalamin group was also significantly higher than Saline group，in GsRg1 group，4 mg group and 8 mg group were all higher than the other two groups of GsRg1，the recovery of GsRg1 2 mg group and 12 mg group were similar with nerve conduction velocity of Mecobalamin group.Conclusion GsRg1 can promote nerve regeneration and functional recovery and optimal dose of（4-8）mg/kg. ［Key words］Ginsenoside Rg1；Sciatic nerve；Nerve injury；Nerve rehabilitation

R651.3

A

1673-9701（2016）14-0027-04