榛花消腎安膠囊干預實驗性糖尿病大鼠足細胞相關蛋白α-actinin-4的研究

趙承雅，韓香蓮，南　征

（1.韓國；2.長春中醫(yī)藥大學，長春　130021；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春　130021）

·國際交流·

榛花消腎安膠囊干預實驗性糖尿病大鼠足細胞相關蛋白α-actinin-4的研究

趙承雅1，2，韓香蓮2，南征3

（1.韓國；2.長春中醫(yī)藥大學，長春130021；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春130021）

［目的］通過實驗觀察實驗性糖尿病（DM）大鼠的腎臟及足細胞相關蛋白α-actinin-4的表達，表明“榛花消腎安膠囊”治療糖尿病腎病的有效性。［方法］建立鏈脲佐菌素（STZ）誘導的實驗性糖尿病大鼠模型分為DM模型組、對照組、中藥組、西藥組，中藥組給予榛花消腎安膠囊，西藥組給予厄貝沙坦片；檢測空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），應用光學顯微鏡和透射電鏡及免疫組化方法觀察足細胞骨架蛋白α-actinin-4的表達；應用實時定量聚合酶鏈反應（PCR）技術檢測α-actinin-4 m RNA表達。［結果］中藥干預之后中藥高、中、低劑量組及西藥對照組尿量較DM模型組明顯減少（P＜0.01）；中藥各劑量組與西藥對照組大鼠血糖均明顯低于DM模型組（P＜0.01）；中藥各劑量組和西藥對照組大鼠α-actinin-4及mRNA含量均低于DM模型組（P＜0.01）。［結論］榛花消腎安膠囊能夠降低實驗性DM大鼠血糖、Scr、BUN，減少尿微量白蛋白的排泄，而改善腎功能；能夠抑制實驗性DM大鼠早期腎臟體積增大，而抑制α-actinin-4蛋白表達及其m RNA的表達。

榛花消腎安膠囊；糖尿病腎病；足細胞α-actinin-4

糖尿病腎病（DN）是臨床上常見而嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，臨床特征為蛋白尿漏出，腎功能進行性惡化，病理變化為腎小球濾過率改變，基底膜增厚，系膜細胞增寬，直至腎小球硬化，發(fā)展至腎功能衰竭。其發(fā)病率隨著糖尿病患者數的增加，愈來愈高，嚴重威脅著人類的健康。DN的發(fā)病機制復雜而多，近幾年來，很多研究表明，各種原因導致在腎小球濾過膜的足細胞損傷參與了糖尿病腎病產生發(fā)展中起很大的作用，因此對足細胞的研究進而改善足細胞功能的藥物成為治療糖尿病腎病的關注點。

導師南征教授認為“毒損腎絡，邪伏膜原”理論是糖尿病腎病的主要病因病機，提出了“解毒通絡，益腎導邪，疏利膜原”治療思路與方法。榛花消腎安膠囊是南征教授常用的治療糖尿病腎病的經驗方，在臨床上療效顯著。通過本實驗觀察實驗性糖尿病大鼠的腎臟及足細胞相關蛋白α-actinin-4的表達影響，表明“榛花消腎安膠囊”治療糖尿病腎病的有效性。

1　材料與方法

1.1實驗方法將70只Wistar雄性大鼠按照隨機數字表法分為正常對照組和模型組，適應性喂養(yǎng)1周。造模1 d前晚上8點到早上8點予將要造模的60只大鼠禁食而不禁水12 h。分批單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）（50 mg/kg），STZ溶解之后20分鐘內用完。同時，正常對照組大鼠則腹腔注射等體檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ 72 h后，尾靜脈采血，測空腹血糖≥16.7 mmol/L則為造模成功，列入觀察對象。實驗動物分組及給藥方法為將造模成功的大鼠隨機分為糖尿病（DM）模型組，中藥高、中、低劑量組（予榛花消腎安膠囊干預治療），陽性對照組（予厄貝沙坦片干預治療）。中藥組予榛花消腎安膠囊混懸液灌胃，高、中、低劑量組分別以1，0.5，0.25 g/（kg·d）（相當于成人臨床用藥量的5、10、20倍）；陽性對照組予厄貝沙坦混懸液20 mg/（kg·d）灌胃；正常對照組及DM模型組予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃觀察12周，每4周測尿微量白蛋白1次。

1.2標本采集

1.2.1血尿生化指標測定每4周用代謝籠收集尿量1次，計量，用離心機3 000 r/min離心10 min，分層后取上清液裝入EP管中，-80℃冰箱中凍存，待檢測尿微量白蛋白；每2周大鼠尾靜脈采血，監(jiān)測血糖；予40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，腹主動脈取血，離心（3 000 r/min，10 min），分層后取血清分裝入EP管中，-20℃冰箱中保存，待測血糖、血脂、腎功能。

作者簡介：趙承雅（1987-），女，韓國，博士研究生，主要研究方向為中醫(yī)藥防治消渴合并癥的研究。

1.2.2免疫組化迅速取出雙腎，放置于生理鹽水中沖洗，去掉腎包膜，濾紙吸干，左腎稱質量，并切取一半置于10%中性福爾馬林液中固定，待石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化。

1.2.3電鏡右腎切取小塊腎皮質，放置于2.5%戊二醛/0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.4）中固定，用于電鏡觀察。

1.2.4實時定量聚合酶鏈反應（PCR） 取1 μL提取的RNA，用NAnoDROP 2000進行提取RNA含量與純度測定。提取組織的RNA為模板，用All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。已合成的cDNA第一鏈為模板，進行相關基因表達的實時定量PCR，根據PCR結果評價各個基因在不同分組內的表達。檢測基因引物設計與合成根據檢測基因序列，用PRIME blast工具進行引物網上設計，引物由北京欣博盛生物技術有限公司合成，每個引物為2OD，純化級別為PAGE級。應用染料法，進行基因表達的實時定量PCR檢測。采用的試劑盒為廣州復能基因公司的All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒。α-actinin-4的No.of Genbank為nm-031675.2，引物序列為上游：GGCTGAGAAGGGCTATGAAGAA，下游：AGAGCTTTGATGTCTGACAGGG，PCR產物長度為180bp。

1.3統計學處理實驗結果采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1腎質量/體質量、24 h尿量、空腹血糖比較實驗結束時，中藥各劑量組與西藥對照組大鼠腎質量/體質量明顯高于DM模型組（P＜0.01）。中藥各劑量組及西藥對照組尿量較DM模型組明顯減少（P＜0.01）；中藥高劑量組較西藥對照組明顯減少尿量（P＜0.01）。DM模型組、中藥各劑量組、西藥對照組大鼠血糖明顯高于正常對照組（P＜0.01）；中藥各劑量組與西藥對照組大鼠血糖明顯低于DM模型組（P＜0.01）；中藥高、中劑量組空腹血糖明顯低于西藥對照組（P＜0.01）。見表1。

2.2腎功能實驗結束時，DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）水平均高于正常對照組（P＜0.01）；中藥各劑量組及西藥對照組大鼠BUN、Scr水平均低于DM模型組（P＜0.01）。見表2。

表1　各組大鼠實驗結束時腎質量/體質量、24 h尿量、空腹血糖比較（±s）Tab.1　Comparison of kidney weight/body weight，24 h urine volume，fasting blood-glucose of rats in each group after experiment（±s）

表1　各組大鼠實驗結束時腎質量/體質量、24 h尿量、空腹血糖比較（±s）Tab.1　Comparison of kidney weight/body weight，24 h urine volume，fasting blood-glucose of rats in each group after experiment（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.01，△P＞0.05。

組別　動物數腎質量/體質量　24 h尿量　空腹血糖正常對照組　9　3.25±0.08　12.11±1.70　5.43±0.64 DM模型組　7　6.30±0.13*　100.36±15.57*21.40±2.49*中藥高劑量組　8　4.29±0.11*#▲　39.25±3.24*#△12.84±1.14*#△中藥中劑量組　8　4.63±0.17*#　58.75±5.31*#▲15.38±0.50*#△中藥低劑量組　8　5.24±0.20*#　67.88±4.26*#17.48±1.03*#▲西藥對照組　8　4.30±0.05*#　53.19±3.44*#17.31±1.21*#

表2　各組大鼠實驗結束時腎功能比較（±s）Tab.2　Comparison of the kidney function of rats in each group after experiment（±s）

表2　各組大鼠實驗結束時腎功能比較（±s）Tab.2　Comparison of the kidney function of rats in each group after experiment（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與西藥組比較，△P＞0.05。

組別　動物數　BUN（mmol/L）　Scr（μmol/L）正常對照組　9　7.18±0.90　40.44±4.15 DM模型組　7　14.10±1.19*　70.49±5.47*中藥高劑量組　8　8.92±1.07*#△　50.35±5.02*#△中藥中劑量組　8　10.44±1.09*#　60.33±5.51*#中藥低劑量組　8　12.21±1.12*#　65.24±4.97*#西藥對照組　8　8.88±0.93*#　49.63±5.22*#

2.324 h尿微量白蛋白動態(tài)變化比較實驗期間，第4、8、12周，DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠24 h尿微量白蛋白（ALB）含量逐漸增加（P＜0.01）；中藥各劑量組和西藥對照組從第4周開始ALB含量較DM模型組降低（P＜0.01）。見表3。

表3　各組大鼠4、8、12周末ALB比較（±s）Tab.3　Comparison of ALB of rats in each group at 4，8，12 weeks（±s）

表3　各組大鼠4、8、12周末ALB比較（±s）Tab.3　Comparison of ALB of rats in each group at 4，8，12 weeks（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與西藥組比較，▲P＞0.05，△P＜0.05。

組別　動物數　4周　8周　12周正常對照組　9　9.87±0.56　10.16±0.47　10.64±0.57 DM模型組　7　25.86±1.28*　36.56±2.19*　50.06±2.54*中藥高劑量組　8　15.05±0.17*#△23.06±0.99*#△31.38±0.88*#△中藥中劑量組　8　17.03±0.57　25.44±0.71*#▲34.65±0.77*#中藥低劑量組　8　19.23±0.69*#　28.88±1.00*#　39.36±0.93*#西藥對照組　8　15.79±0.42*#　24.48±0.48*#　32.66±0.79*#

2.4病理組織學改變1）光鏡觀察：正常對照組大鼠腎小球無明顯異常，系膜細胞（MC）無增生，腎小球系膜區(qū)細胞外基質（ECM）無明顯增多，絕大部分毛細血管袢開放，間質無明顯炎細胞浸潤，無纖維組織增生，腎小球囊無滲出、無粘連，近端小管結構正常；DM模型組大鼠腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬，腎小球基底膜（GBM）增厚，MC輕度增生，腎小球ECM增多，部分毛細血管受壓而塌陷，間質纖維組織增生，腎間質中炎性細胞浸潤，腎小球囊粘連；中藥各劑量組、西藥對照組腎小球結構也有類似病理改變，但較DM模型組明顯減輕，大鼠腎小球ECM增多、MC增生較DM模型組明顯減輕，大部分毛細血管腔處于開放狀態(tài)，間質纖維組織增生較DM模型組減少。2）電鏡觀察：正常對照組大鼠腎小球濾過膜結構完整，毛細血管內皮細胞正常，GBM薄厚均勻，足細胞結構完整，足突排列整齊、清晰、分布均勻，系膜區(qū)未見擴大，系膜基質無明顯增多；DM模型組大鼠腎小球濾過膜明顯改變，GBM彌漫性增厚，內皮細胞廣泛融合、增生，足細胞足突廣泛融合，足細胞數目減少，系膜區(qū)擴大，基質明顯增多；中藥各劑量組與西藥對照組病理改變不同程度減輕，大鼠腎小球毛細血管內皮細胞正常，GBM未見增厚，足突部分融合，系膜區(qū)未見明顯擴大。

2.5α-actinin-4蛋白表達正常對照組的α-actinin-4蛋白沿著腎小球基底膜毛細血管樣點線狀分布均勻（圖1A）；DM模型組的α-actinin-4蛋白表達明顯高于正常對照組（圖1B）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組的α-actinin-4蛋白表達較DM模型組減弱（圖1C～F）。DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠α-actinin-4灰度值均高于正常對照組（P＜0.01）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組大鼠灰度值均低于DM模型組（P＜0.01）。見表4。

2．6α-actinin-4 m RNA的表達DM模型組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組大鼠的α-actinin-4 mRNA含量均明顯高于正常對照組（P＜0.01）；中藥高、中、低劑量組和西藥對照組α-actinin-4 m RNA含量均低于DM模型組（P＜0.01）。見表5。

3　討論

近幾年來，中國DM患者人數與日俱增，約占全球DM患者人數的三分之一，已經成為DM患病率較高的國家之一，2型DN的發(fā)生率約33%-48%［1］。DN是糖尿病的常見而慢性微血管并發(fā)癥，導致慢性腎功能衰竭的主要原因，亦是DM患者的主要死亡原因。

圖1　各組大鼠腎臟α-actinin-4免疫組化（×400）Fig.1　Immunohistochemical staining of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（×400）

表4　各組大鼠腎組織α-actinin-4蛋白比較（±s）Tab.4　Comparison of the protein exprossion of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（±s）

表4　各組大鼠腎組織α-actinin-4蛋白比較（±s）Tab.4　Comparison of the protein exprossion of α-actinin-4 in kidney of rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別　動物數　α-actinin-4正常對照組　9　54.57±6.16* DM模型組　7　143.78±4.84中藥高劑量組　8　63.25±5.15*#中藥中劑量組　8　66.25±5.04*#中藥低劑量組　8　102.13±4.52*#△西藥對照組　8　96.38±5.48*#

“毒損腎絡”是導師南征教授提出的消渴腎病的病機關鍵之一。毒是指一切對機體的生理功能產生不良影響的致病因素。毒邪分為內毒和外毒，外毒是指外邪直接侵入機體，而致機體受損的一類物質；內毒是指由臟腑功能失常和氣血運行失調，使體內的病理產物不能及時排出，積久造成氣滯、血瘀、痰凝、濕濁、水停等病理產物，邪盛而成熱毒、瘀毒、痰毒、濕毒、濁毒、燥毒等毒邪。毒邪多在疾病過程中產生，又是繼續(xù)損害機體的因素，會形成惡性循環(huán)。因消渴病遷延日久，則散膏損傷，三焦氣化受阻，脂膏堆積，痰濕、濕熱、瘀滯相結成毒邪，其毒邪伏于膜原，毒損腎絡，腎體用皆損，腎間動氣大傷，氣血逆亂，而成消渴腎病［2］。依秋霞等［3］認為，因消渴日久，脂毒內生，阻于腎絡氣機運行，阻礙津血運行，凝聚而成膏脂，亦可成痰瘀，致病的膏脂與新產生的膏脂和痰瘀膠著黏滯，再生新的毒邪，而損傷腎絡，循環(huán)往復，終致消渴腎病。毒損腎絡與消渴腎病密切相關，脂毒在病情過程中起關鍵的作用。“邪伏膜原”是導師南征教授近期提出的理論，是根據消渴腎病的纏綿難愈特點，又深入研究膜原的范圍和作用而提出。從后世許多醫(yī)家對膜原的描述上來認為，膜原是一種膜樣組織，包括臟腑間聯系膜，肌肉筋骨間膜、胸膜、腹膜等組織以及現代醫(yī)學中腎小球濾過膜等微觀結構，其分布廣泛，具有聯系機體表層與內深層各個組織，溝通氣血，輸布津液，起著橋梁與紐帶作用。南征［4］認為，治療消渴腎病的治則為扶正祛邪，攻補兼施。治以解毒通絡益腎、調散膏、達膜原。榛花消腎安膠囊是南征教授常用的治療糖尿病腎病的經驗方，在臨床上療效顯著。組成為榛花、土茯苓、黃芪、覆盆子、穿山甲、血竭、金蕎麥、益母草、草果、檳榔、厚樸，具有解毒通絡，益腎導邪疏利膜原之功。α-actinin-4是肌動蛋白交連蛋白，維持細胞結構起重要作用，能交聯肌動蛋白微絲，將肌動蛋白交聯成可收縮的纖維束［5］。主要表達于足細胞，其基因突變可引起足突融合、消失，致使蛋白尿的產生。高糖和糖基化終末產物（AGEs）均可使α-actinin-4表達的減少，可致DN腎小球足細胞骨架的破壞［6］。Dandapani等［7］研究發(fā)現，不夠α-actinin-4鼠的腎小球足細胞數量與尿中足細胞的含量均減少。在高糖與晚期糖基化產物聯合下，足細胞αactinin-4的表達減少。楊曉等［8］觀察研究造模DM大鼠的α-actinin-4表達水平，隨著病情進展，αactinin-4水平逐漸減少，可參與DM大鼠蛋白尿的產生，可能與糖基化終末產物（AGEs）的含量增多有關。段玉紅等［9］研究發(fā)現，糖尿病時持續(xù)高血糖，脂代謝紊亂特異性損害Nephrin、α-actinin-4的表達，并造成足細胞損傷，是足細胞數目減少，出現尿蛋白。

表5　各組大鼠腎組織α-actinin-4 mRAN表達水平的比較（±s）Tab.5　Comparison of α-actinin-4 mRAN expression levels in kedney of rats in each group（±s）

表5　各組大鼠腎組織α-actinin-4 mRAN表達水平的比較（±s）Tab.5　Comparison of α-actinin-4 mRAN expression levels in kedney of rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01；與西藥組比較，△P＞0.05。

組別　動物數　α-actinin-4 mRNA正常對照組　9　0.28±0.06* DM模型組　7　0.86±0.08中藥高劑量組　8　0.40±0.04*#中藥中劑量組　8　0.57±0.04*#中藥低劑量組　8　0.58±0.06*#△西藥對照組　8　0.46±0.07*#

本實驗表明，榛花消腎安膠囊能夠改善實驗性DM大鼠的一般狀態(tài)，降血糖、血肌酐和尿素氮；改善實驗性DM大鼠腎臟組織的病理結構，減輕腎小球基底膜增厚，細胞外基質的積聚，系膜增生，改善足細胞形態(tài)，從而減輕DM性腎小球硬化；能夠抑制實驗性DM大鼠早期腎臟肥大，減少ALB的排出，改善腎功能，而且能夠抑制實驗性DM大鼠腎組織α-actinin-4蛋白及m RNA的表達。

［1］張真真.中西醫(yī)結合糖尿病腎病高峰論壇在京召開［N］.中國中醫(yī)藥報海外版，2011-01-08（1）.

［2］南征，樸春麗，何澤，等.消渴腎病診治新論［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5（8）：598-599.

［3］依秋霞，生生，李敬林，等.從脂毒及毒損腎絡探討糖尿病腎病病理機制［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報2014，16（3）：58-59.

［4］南紅梅，周鳳新，韓香蓮，等.南征教授治療消渴腎病新路徑［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2012，28（1）：52-53.

［5］Dessapt C，Hargreaves R，Dei CA，et al.Modulation of alpha 3-beta 1 integrin expression and cell adhesion in glomerular podocytes by glucose and mechanical stretch［J］.Diabetic Med，2004，21（2）:10-11.

［6］Lu C，Ren W，Su XM，et al.CREB and Spl regulate the human CD2AP gene promoter activity in renal tubular epithelial cells.Archives of biochemistry and biophysics，2008，474（1）:143-149.

［7］Dandapani SV，Sugimoto H，Matthews BD，et al.Alpha-actinin-4 is required for normal podocyte adhesion［J］.J Biol Chem，2007，282（1）: 467-477.

［8］楊曉，孫希鋒，張春.糖尿病大鼠腎臟α-輔肌動蛋白-4表達變化及作用機制［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2008，9（3）:195-198.

［9］段玉紅，田小燕，王維剛，等.Nephrin，α-actinin-4在糖尿病大鼠腎組織中的表達及其與足細胞數目的相關性研究［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2012，29（1）：41-44.

（本文編輯：馬英，滕曉東）

Study on the podocyte associated protein α-actinin-4 of experimental diabetic rats treated with Zhenhua Xiaoshen An capsules

ZHAO Cheng-ya1，2，HAN Xiang-lian2，NAN Zheng3
（1.Korea；2.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China；3.The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China）

［Objective］Through this experiment to observe the experimental diabetic rats renal and podocyte associated protein α-actinin -4 expression，indicate Zhenhua Xiaoshen An capsules effectiveness of diabetic nephropathy in the treatment of diabetic nephropathy. ［Methods］To establish the model of STZ induced diabetic rats model group，control group，Traditional Chinese medicine group，Western medicine group.Traditional Chinese medicine group was given Zhenhua Xiaoshen An capsule.Western medicine group was given irbesartan.Fasting blood glucose，24 h Urine micro albumin，Scr，BUN were detected with optical microscope，transmission electron microscope and immunohistochemistry in order to observe the expression of podocyte skeletal protein α-actinin-4.The expression of αactinin-4 mRNA were detected with Real-time quantitative PCR.［Results］After the intervention，the urine volume of traditional Chinese Medicine traditional Chinese medicine high，middle，low dose group and Western medicine control group obviously decreased，compared with that of DM model group（P＜0.01）.The blood glucose of rats in Traditional Chinese medicine every dose group and Western medicine control group were obvious lower than that in DM model group（P＜0.01）.The α-actinin-4 mRNA contents of rats in traditional Chinese medicine every dose group and Western medicine control group were lower than that in DM model group（P＜0.01）.［Conclusion］Zhenhua Xiaoshen An capsules can reduce to experimental DM rats blood glucose，serum creatinine，blood urea nitrogen and excrete urine micro albumin，and improve renal function.It also can restrain the incresing of the renal volume of experimental DM rats at early stage and the protein and mRNA expression of α-actinin-4.

Zhenhua Xiaoshen An capsule；diabetic nephropathy；podocyte；α-actinin-4

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.15

R587.1

A

1672-1519（2016）07-0440-05

2016-03-28）