PK15細胞全懸浮搖瓶培養工藝初探

溫靈燕 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15是一株癌變的豬腎傳代細胞系，中文名為豬腎上皮細胞，父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細胞PK-2a，被ATCC收藏（CCL-33）[1]。細胞具有很高的生長和增殖能力，可以無限傳代。該細胞對豬圓環病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒等多種病毒比較敏感，已廣泛應用于獸用疫苗的研究和生產[2]。傳統PK15細胞培養大多是貼壁型培養，但細胞貼壁轉瓶培養工藝已不能滿足產業化疫苗生產需求，而且PK15細胞在貼壁培養中會出現生長不穩定的情況，反復傳代過程中細胞極容易抱團，之后就可能表現出生長不良甚至不能繼續傳代等情況。貼壁細胞生產放大采用的細胞工廠或轉瓶工藝，勞動強度大，可使用的細胞密度低，制約了規模化疫苗生產工藝發展。

全懸浮培養技術與貼壁的轉瓶培養技術相比有很大優勢。全懸浮培養不需要載體，不需要血清，也不需要胰酶消化培養，減少人為介入，最重要的是細胞的生長密度不受附著物限制，工藝放大更簡單，只需要增加培養體積即可，能更快擴大生產規模，保證產品質量穩定性和均一性，提高勞動效率，長期使用成本低。本試驗初步探討PK15細胞全懸浮條件下在錐形瓶上的生長和產毒情況，為之后放大至反應器全懸浮培養提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 PK15懸浮細胞株，由兆豐華生物科技（福州）有限公司自主馴化、保存；PCV2-DBN-SX07，由兆豐華生物科技（福州）有限公司提供。

1.1.2 培養基 MEM，購自壹生科公司。

1.2 儀器設備 搖床；倒置生物顯微鏡37XB，購自上海光學儀器一廠；臺式低速離心機，購自上海醫療器械（集團）有限公司手術器械廠。

1.3 方法

1.3.1 健康細胞制備 復蘇一支凍存密度約為0.66×106個/mL的PK15懸浮細胞，離心后，棄上清，用預熱的壹生科MEM培養基輕輕吹打后全部加入至250 mL搖瓶中，搖瓶液體裝量為75 mL，混勻，取樣，計數，記錄起始細胞密度。放置在搖床上培養，分別在24 h、48 h、72 h取樣，在顯微鏡下觀察細胞的形態，并用血球計數板計數，記錄細胞密度。

1.3.2 細胞傳代 細胞長至72 h時，按傳代后所需要的細胞數計算出所需吸取的細胞懸液，1 000 r/min離心5 min后，棄上清，加入新鮮的懸浮培養液，放置搖瓶中混勻，取樣，計數，記錄起始細胞密度。于37℃CO2培養箱培養，分別在24 h、48 h、72 h取傳代的細胞樣品計數，在顯微鏡下觀察細胞形態并用血球計數板計數。以此方法連續傳代3次。

1.3.3 接毒試驗 取一瓶生長良好的全懸浮細胞按相同的起始密度分成3個搖瓶細胞，按1%、3%、5%接毒量接種PCV2-DBN-SX07，病毒效價為106.5TCID50/mL。在72 h、96 h、120 h分別取樣，觀察細胞狀態并留樣測毒。共進行三次重復試驗。

2 結 果

2.1 PK15懸浮細胞搖瓶生長狀態觀察試驗 從圖1可以看到，細胞在72 h時處于生長旺盛時期，所以本試驗傳代的時間選擇在72 h。PK15懸浮細胞在剛復蘇時生長速度比較緩慢，在0～24 h，細胞處于潛伏期，細胞數目稍有增加；24～48 h處在適應期，細胞開始慢慢適應，生長密度為起始密度的2.27倍；到72 h細胞密度達到初始密度的3.03倍（見表1）。細胞適應一代后，在24 h細胞密度達到初始密度的3.06倍，在48 h達3.62倍，到72 h為4.1倍（見表2）；細胞適應二代后，增長倍數在72 h達到了8.1倍（見表3），而且細胞狀態越來越好，越來越圓潤透亮。從鏡下觀察細胞的形態（見圖2），三次培養的細胞除了在密度上有差別外，形態上差別不大，均比較圓潤，光澤度佳，細胞呈單個，極少數有兩個或三個的小團塊，是比較理想的懸浮細胞的狀態。

表1 PK15懸浮細胞第一次生長情況

表2 PK15懸浮細胞第二次生長情況

表3 PK15懸浮細胞第三次生長情況

圖1 三次細胞生長折線圖

圖2 不同時間段細胞在顯微鏡下的狀態

2.2 PK15懸浮細胞產毒試驗 本試驗按照三個接毒量（1%、3%、5%）進行比較。由第一次產毒試驗結果可以看出（見表4、圖3），1%接毒量的細胞產毒效價比3%和5%略高，接毒量3%比5%的產毒效價略高，收獲病毒時間在72 h的效價比96 h和120 h效價高。故第一次產毒試驗1%接毒量和收獲時間72 h是比較好的工藝。

表4 第一次接毒的效價結果

圖3 第一次接毒的效價結果折線圖

從表5、圖4可以看出，第二次產毒試驗1%接毒量的效價比3%和5%略高，收獲病毒時間也是在72 h比96 h和120 h效價高。故第二次產毒試驗1%接毒量和收獲時間在72 h也是比較合適的工藝。

圖4 第二次接毒的效價結果折線圖

表5 第二次接毒的效價結果

從表6、圖5可以看出，第三次產毒試驗3%接毒量的效價比1%和5%都更有優勢，在72 h時1%接毒量的效價比3%和5%略低一些，但在96 h和120 h的效價都比3%和5%接毒量略高。第三次產毒試驗3%接毒量和收獲時間在72 h是比較合適的工藝。

圖5 第三次接毒的效價結果折線圖

表6 第三次接毒的效價結果

3 小結與討論

在培養條件、接種密度合適的情況下，細胞能在比較短的時間內達到對數生長期。本試驗初步探索了PK15細胞懸浮搖瓶培養和接毒工藝，結果表明：細胞接種密度在0.5×106個/mL～0.6×106個/mL，可以使PK15細胞在搖瓶上生長，且細胞在搖瓶的最適傳代時間為72 h。三次接毒結果初步確定，在起始密度一樣的條件下，接毒量為1%和3%都是搖瓶培養適合的接毒工藝；收獲病毒時間在72 h比96 h和120 h更有優勢。但是從規模化生產考慮，接種劑量的大小和收獲時間的長短是重要的因素。接毒量小可以節省種毒量，收獲時間短也可以縮短生產周期，故選擇1%接毒量和收獲病毒時間在72 h作為最適的搖瓶培養工藝方案。后期將進一步開展生物反應器大規模培養工藝研究。