纖維連接蛋白EDA片段功能及臨床應用前景研究進展

蔡晶晶，王雅潔(綜述)，嚴繼貴(審校)

(安徽醫學高等?？茖W校藥學系生物制藥教研室，安徽 合肥 230601)

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纖維連接蛋白EDA片段功能及臨床應用前景研究進展

蔡晶晶，王雅潔(綜述)，嚴繼貴*(審校)

(安徽醫學高等?？茖W校藥學系生物制藥教研室，安徽 合肥 230601)

[關鍵詞]纖連蛋白類;EDA片段；綜述文獻

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.033

蛋白結構域A(extra domain A， EDA)是纖維連接蛋白(fibronectin, FN)的可剪切結構域之一，在機體的胚胎發育、血管生長、細胞遷移及細胞分化中發揮重要作用，與腫瘤、纖維化、血栓等多種疾病相關?，F就EDA的結構、生物學功能以及EDA臨床應用研究進展綜述如下。

1　EDA的結構與位置

FN是構成細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的一種大分子糖蛋白，FN有2種形態，可溶型FN由肝臟實質細胞分泌直接釋放至周圍環境中，不溶型FN沉積于組織ECM中。FN由2條結構相近相對分子質量約為250 000的亞基組成，亞基由3種不同類型的重復序列組成(12 typeⅠ、2 typeⅡ和15 typeⅢ)，FN的pre-mRNA可選擇性剪切從而產生20余種變體，其中部分FN Ⅲ區域產生的剪切變體中含有EDA外顯子與蛋白結構域B(extra domain B，EDB)外顯子，EDA位于FNⅢ 11與12之間，EDB位于FNⅢ 7與8之間[1-2](圖1)。成人正常組織中往往沒有EDA，但是在組織修復、組織纖維化、血管生成和細胞遷移等特定條件下EDA表達量會上調。

圖1　纖維連接蛋白結構

2　EDA的生物學功能

2.1參與胚胎血管生成與腫瘤血管發育在脊椎動物的胚胎發育階段EDA含量非常豐富，它們在胚胎發生、血管生長、細胞遷移與細胞分化中發揮重要作用。純合子突變小鼠實驗證實，FN基因中EDA與EDB的缺失會造成胚胎心血管發育異常，造成血管出血、卵黃囊血管無法構建、心臟血管缺陷等一系列病癥，從而致胚胎死亡，其發生機制可能與內皮細胞的極性缺失有關，導致形成異常的管狀結構。但EDA或者EDB單個的缺失并不影響血管的發育，原因可能是EDA與EDB的功能在某些方面存在互補。盡管EDA在胚胎血管形成時表達，但成人組織正常情況下檢測不到，而在腫瘤血管生成與基質重建時重新出現，EDA+FN及其mRNA在肝癌、結腸癌、乳腺癌、神經膠質瘤等腫瘤的血管內皮細胞、血管平滑肌及血管周圍基質中普遍呈高表達，提示EDA與腫瘤血管的生成也具有密切的關系[2]。

2.2在淋巴管發育與腫瘤淋巴轉移中的作用EDA+FN在淋巴管形成與發育中有關鍵的作用，研究表明在胚胎發生期間，由α9整合素表達的上調和EDA+FN在ECM的沉積共同激發淋巴瓣小葉的形成，若EDA-α9整合素相互作用缺失則會導致瓣膜發育缺陷。EDA可以促進淋巴管生成中一些關鍵因素如轉錄因子Prox1、纖維狀激動蛋白(F-actin)的分泌與表達，從而促進人淋巴管內皮細胞的出芽、遷移[3]。鼠移植結腸瘤模型中，EDA可以通過促進血管內皮生長因子C(vascular endothelial cell growth factor C,VEGF-C)的分泌來促進腫瘤生長與腫瘤淋巴管的生成，并促進腫瘤細胞的淋巴道轉移[4]，EDA有望成為一種有效抑制腫瘤淋巴轉移的治療目標。

2.3在組織纖維化中的作用EDA+FN參與肺纖維化、肝纖維化、腎間質纖維化等病理性進程，究其原因：EDA+FN可作為 轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的重要底物參與誘導成纖維細胞增殖分化、上皮間質轉化、成纖維細胞的胞外基質產生、巨噬細胞脂蛋白代謝、組織纖維化等[5-6]。在組織創傷部位TGF-β被激活，活化的TGF-β促進FN的選擇性剪接提高EDA的表達，TGF-β與EDA+FN相互作用促使纖維原細胞(成纖維細胞)向表達α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)的肌成纖維細胞轉化并產生纖維化。在敲除了EDA基因的小鼠模型損傷部位則不能實現這種轉化，繼而也不能形成纖維化組織[7]。

2.4在血栓形成中的作用FN參與血小板的血栓形成，它與血小板表面受體結合，并通過凝血因子ⅩⅢ共價連接于血纖蛋白。血小板α顆粒中含有EDA+FN，并在動脈粥樣硬化、肺和血管急性損傷、糖尿病、血小板減少性紫癜與缺血性卒中等疾病發生時表達量明顯增加。EDA+FN影響血漿脂蛋白的代謝與泡沫細胞的形成，EDA缺陷型小鼠發生動脈粥樣硬化的概率則大幅度降低。而純合子EDA+/+小鼠血漿FN表達量只有野生鼠的20%～30%，其血栓形成的速率卻較野生鼠大幅度增加[8]。表明EDA+FN的病理性上調會顯著增加機體血栓形成的風險。

3　EDA的相關受體及信號通路研究

3.1EDA與整合素家族的相互作用整合素家族是位于細胞表面的FN的特異性受體，常與EDA+FN結合的受體有α9β1、α4β1、α4β7等整合素。

EDA與α9β1的相互作用通常發生在上皮細胞與血管內皮細胞上，介導細胞遷移與FN基質的構建，并促進淋巴管瓣膜發育。結腸癌、肺癌中皆發現EDA+FN通過與相鄰癌細胞上的α9β1相互作用，來激活胞內FAK/Rac、PI3-K/Akt及ERK1/2等信號通路，促進上皮細胞-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)，發揮誘導癌細胞分散、促進細胞遷移及侵入基底膜等生物學作用[9-10]。SW480細胞體外培養實驗發現，EDA-α9β1作用可活化Wnt/β-catenin信號通路，促進CD133+/CD44+表達及細胞亞群的成瘤能力，從而促進腫瘤的發展[11]。

EDA與α4β7整合素受體結合主要參與、誘導成纖維細胞的分化，EDA+FN與α4β7相互作用增加SMA的表達，促使膠原蛋白沉積、細胞收縮，并激活局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)與MAPK-ERK1/2相關的信號通路[12]。抑制α4β7的表達則會阻礙EDA所引起的上述生物學作用。表明EDA與α4β7整合素的相互作用是誘導成纖維細胞分化不可或缺的環節。

EDA與α4β1相互作用可刺激p44/42 MAP激酶磷酸化，影響細胞黏附，促進細胞收縮，介導細胞遷移的速率，促進纖維連接蛋白的合成與沉積，促進組織纖維化的形成[13]。

3.2EDA-TLR4的相互作用EDA另外一個重要的受體是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，EDA活化TLR4后產生一系列生物學反應，如動脈粥樣硬化血管重構、特異性細胞免疫應答、激活肥大細胞、促進中性粒細胞遷移與單核細胞中白三烯的合成等，從而使EDA+FN在炎癥發生與免疫應答中發揮重要作用[1]。纖維蛋白EDA作為TLR4的內源性配體，具有高度的免疫原性，可攜帶抗原靶向到達表達TLR4的樹突狀細胞(dendritic cells，DC)，DC是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，TLR4識別EDA-抗原融合蛋白配體后，增強免疫原與DC的結合，激活下游核因子κB信號通路，促進人單核細胞系與DC中腫瘤壞死因子α和白細胞介素12的釋放[14]。EDA-抗原融合蛋白增強DC的抗原提呈功能，誘導強烈的抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的免疫反應。

4　EDA的應用

4.1EDA作為診斷指標的研究在結腸癌、肝癌、甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤的病理性進程中EDA表達量特異性升高，在腫瘤基質、腫瘤基底膜、腫瘤血管中大量存在，而在正常組織中未檢測到EDA蛋白，肺癌、乳腺癌等癌癥患者的血液樣本中EDA+FN含量可高達20 mg/L，顯示EDA可作為部分實體瘤發生與遷移時的診斷指標。研究結腸癌患者發現其腫瘤組織與血清中的EDA水平相對于早期大幅增加，EDA表達水平與腫瘤細胞分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、化療藥物耐受性及結腸癌患者預后不良呈顯著正相關[4,11]。EDA在鼻咽癌患者的血清與腫瘤組織中大量表達，腫瘤組織中的EDA水平與癌癥細胞的分化程度與淋巴結轉移密切相關[15]。另外，EDA在肝癌細胞及腫瘤附近的肝硬化中表達，但在非腫瘤性肝組織中不表達，肝細胞活組織檢查中EDA的檢測可作為肝癌診斷有用的輔助指標。

其他一些疾病中EDA也特異性表達，如成熟骨骼組織中檢查不到EDA的表達，但在骨折創傷愈合組織與骨肉瘤細胞樣品中卻顯示EDA+FN表達量顯著增加，而在骨不愈合情況下則EDA表達量很低，顯示EDA+FN可作為骨骼愈合、增生及骨肉瘤形成的特異性指標[16]。此外，EDA還可作為鑒別早期與晚期類風濕性關節炎，區分細菌性與病毒性腦脊髓膜炎的診斷指標[17]。

4.2以EDA抗體為載體的腫瘤生物靶向治療腫瘤生物靶向治療是將殺傷腫瘤細胞的活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，限定在特定的靶細胞、組織或器官內而提高療效，減少不良反應。EDA在一些浸潤性腫瘤的新生血管及組織中特異性表達，研究針對EDA的高親和力的抗體，可攜帶藥物定位于腫瘤組織，可開發成靶向性抗腫瘤生物藥物。Villa等[2]開發了3種針對EDA的3種單克隆抗體，即F8、B7與D5，其中F8與抗原親和力最高，在生物分布實驗中靶向性最好，臨床實驗證實F8在小鼠與人體中具有相似的親和性，并且觀察到EDA在實體瘤與血液惡性腫瘤中均高表達，這拓寬了抗體F8在靶向治療中的適用范圍，使得F8可作為有效的靶向抗癌治療載體。F8抗體可以特異性識別高表達EDA+FN的血管與基質，實驗證明F8-白細胞介素2-紫杉醇復合物可以有效抑制黑色素瘤的進展，提高自然殺傷細胞抗腫瘤活性，提高宿主反應，有效降低腫瘤負荷與肺轉移結節數。該治療法具有很高的靶向特異性，藥物安全性好[18]。

4.3將EDA作為腫瘤治療的靶點結腸癌細胞的增生引起EDA的上升，而EDA在促進惡性腫瘤的淋巴管生成中起重要作用，加速了腫瘤的轉移，該研究表明EDA信號通路可作為抗腫瘤淋巴結轉移的潛在治療靶點[3]。研究顯示內皮抑制素可以顯著抑制結腸癌SW480細胞中EDA的分泌，并抑制淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cell,LEC)中整合素α9的表達，從而破壞LEC骨架抑制癌細胞中淋巴管的形成，抑制腫瘤的惡性進展[19]。若敲除EDA，則腫瘤干細胞相關標記物表達降低，細胞成瘤能力與遷移能力降低，已有證據表明阻斷EDA與其整合素受體α9β1結合，可抑制腫瘤進展并減少直腸癌祖細胞生長[11]。EDA有望成為腫瘤治療的靶點。

4.4EDA在其他疾病治療中的研究Schwager等[20]構建了F8-白細胞介素10融合蛋白，可特異性識別炎癥組織中的血管，與甲氨喋呤聯合用于類風濕性關節炎的治療，已進入一期臨床研究階段。Franz等[21]運用EDA抗體靶向治療系統用于心臟疾患的診治，F8可精確定位于EDA表達豐富的血管及纖維化區域，適用于抗體介導的慢性排斥反應的成像觀察，用于疾病的早期診斷及靶向治療。

在纖維化疾病研究中發現，EDA+FN是纖維化ECM的重要組成部分，TGF-β1誘導EDA-FN的生成作用是依賴于PI3-K/Akt信號通路及拼接調節蛋白SRp40的產生，針對mRNA轉錄前的剪接過程來跳過EDA外顯子可能是攻克纖維化的一個有潛力的探索方向[22]。通過RNA干擾與阻斷TLR4通路可以使EDA應答失效，也可以作為治療硬皮癥患者皮膚纖維化的選擇方案[23]。

4.5以EDA為載體的疫苗研制EDA可以作為非常有效的蛋白質載體來攜帶抗原靶向到達DC，誘導DC成熟發揮治療癌癥、抗感染或抗病毒的作用。Femel等[24]構建細菌硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)與EDA的融合蛋白，Trx-EDA接種至乳腺癌小鼠體內可以產生高滴度的抗EDA抗體，增強腫瘤周邊組織的巨噬細胞浸潤，破壞腫瘤血管功能，降低小鼠腫瘤負荷及腫瘤轉移率，顯示Trx-EDA疫苗可以顯著抑制原發性腫瘤的生長及轉移，并抑制腫瘤復發。EDA受體TLR4可識別來源于微生物的具保守結構的分子并產生免疫細胞應答，EDA與乳頭狀病毒E7蛋白(human papil lomavirus E7,HPVE7)構建的融合蛋白(EDA-HPVE7)可以誘導抗腫瘤CD8+T細胞免疫，提示該融合蛋白具有研制成針對人類宮頸癌治療性疫苗的巨大潛力[25]。將EDA與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)保守抗原p24偶聯，協以TLR3的特異性配體poly(I:C)做佐劑，可以促進DC攝取遞呈p24抗原，誘導高效特異的T細胞免疫應答，并誘導產生γ干擾素，提高對HIV蛋白的免疫原性，在HIV的疫苗研究中開啟新的途徑[26]。此外，EDA還可以與甲型肝炎病毒蛋白融合制備成抗甲型肝炎感染的疫苗。

5　展　　望

細胞EDA作為ECM的組成部分，參與了胚胎發育、創傷愈合、腫瘤發生、炎癥反應等多種生理、病理進程，在疾病的診斷與治療研究中越來越重要。目前報道的EDA分布大多位于血管壁、細胞、組織及基質中，另外有報道鼻咽癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌等血漿或血清EDA+FN的表達量提高，但腫瘤種類與血液樣本關聯研究并不充分，EDA是否可作為新的血液檢驗指標用于腫瘤等疾病的診斷和治療效果評價，尚需進一步探討。EDA與不同腫瘤細胞的分化程度及纖維化程度的相關性也需要進一步的研究來發現。EDA作為載體在靶向治療及預防研究中顯示了巨大的應用潛力，但目前僅F8-白細胞介素10、甲氨喋呤聯合用于類風濕性關節炎的治療已經進入一期臨床研究，其余的處于臨床前試驗水平，其臨床方面的應用性研究仍需深入，并且有很大的開發空間。

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(本文編輯：許卓文)

[收稿日期]2015-10-12；[修回日期]2016-03-24

[基金項目]安徽省高校自然科學研究項目(KJ2015A420)

[作者簡介]蔡晶晶(1983-)，女，安徽合肥人，安徽醫學高等?？茖W校講師，理學碩士，從事基因工程藥物研究。 *通訊作者。E-mail:yanjigui1210@126.com

[中圖分類號]R341.22

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)05-0617-04